血管内皮生长因子165基因对大鼠血管损伤后重塑的实验研究

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【摘要】 目的 探讨局部转染血管内皮生长因子165基因（VEGF165cDNA）对大鼠血管球囊拉伤术后血管重塑的影响。方法 制备VEGF165cDNA基因，将30只SD大鼠随机分为基因组、手术对照组及正常对照组（各10只），基因组通过尾静脉输入VEGF165cDNA基因，手术对照组及正常对照组只注入生理盐水，应用免疫组织化学、电镜、光镜等方法观察球囊拉伤后的大鼠股动脉内膜的变化，检测拉伤局部内膜VEGF165基因作用效果。结果 基因组球囊拉伤血管24 h后内膜处有少量中性粒细胞浸润，手术对照组损伤内膜有较多的中性粒细胞浸润，14 d后基因组球囊拉伤血管内膜厚度小于手术对照组（P＜0.01），管腔内径大于手术对照组（P＜0.01），内膜有大量VEGF蛋白表达。结论 病理性重塑是血管损伤后再狭窄的主要原因，而VEGF165基因可促进内皮细胞增生，加速损伤内膜的修复，抑制血管内膜平滑肌细胞的增生进而防治再狭窄。

【关键词】 VEGF165基因；血管重塑

文章编号：1003-1383(2011)04-0409-03 中图分类号：R 543 文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2011.04.003

Experimental study on vascular reconstruction of rats by using VEGF165cDNA gene

CHENG Yedong1，CAI Liping2，WANG Jiabo1,GAO Chao1,FENG Haibo1,JIANGPeng1

(1.Department of Orthopedics 2.Ultrasound,No. 82 Hospital of PLA,Huaian,Jiangsu,223001)

【Abstract】 Objective To investigate the effect of VEGF165cDNA Gene of local transfection on vascular reconstruction after sacculus angioplasty of rats. Methods VEGF165cDNA Gene was prepared and 30 SD rats were randomly divided into the gene group,operation group, and control group,10 for each group. VEGF165cDNA Gene was injected into the tail vein of the gene group while physiological brine into the other two groups. Immuno histochemis-try,eletromicroscope and lightscope were applied to observe the changes of femoral artery intima of rats after the sacculus damage and detect the effect of VEGF165cDNA Gene on the damage of local intima. Results 24 hours after the sacculus artery damage,the intima of the gene group was infiltrated with small amount of neutral granule cells, while the intima of the operaton group with more. 14 days after sacculus artery damage, the gene group had thinner intima than the operation group（P＜0.01）,and bigger inner diameter（P＜0.01）,with great amount of VEGF165 protein expression.Conclusion Pathological reconstruction is the main factor of stricture after blood vessel damage,while VEGF gene helps to stimulate the proliferation of endothelial cell,accelerate the recovery of the damaged intima,inhibit proliferation of vascular smooth muscle cell of the intima and prevent stricture.

【Key words】VEGF165cDNA Gene；vascular reconstruction

血管内皮生长因子具有促进损伤内膜的迅速增生，加速损伤内膜的修复，抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，目前已广泛应用于临床及实验研究，本实验应用局部转染血管内皮生长因子165基因（VEGF165cDNA）转染球囊拉伤的血管内膜，观察血管内膜修复的情况，以观察是否能达到防治血管病理性重塑的目的。

材料与方法

1.动物与主要仪器及试剂 雄性SD大鼠，质量为200～250 g（购自第二军医大学动物实验中心），VEGF165cDNA由本科室与复旦大学生物工程研究室制备(制备的VEGF165cDNA的浓度为10 mg/ml)，并行活性鉴定；VEGF免疫组化试剂盒购自中山生物技术有限公司。

2.分组与模型建立 将30只SD大鼠随机分为基因组（10只）、手术对照组（10只）、正常对照组（10只）。基因组于术后即刻从尾静脉输入VEGF165cDNA药液1 ml（2 mg）。手术对照组及正常对照组仅从尾静脉输入生理盐水1 ml。动物模型的制备：戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉SD大鼠，仰卧固定于手术台上，沿股动脉走向作纵切口，钝性分离股动脉，提拉近侧端，将股动脉剪一小口，逆行插入自制简易微型球囊导管，插入深度为1～2 cm，向球囊内充气使其膨隆，并缓慢回拉导管至切口处，抽出气体，再将导管送入，反复3次，退出导管，缝扎切口。精心饲养。

3.观察指标

（1）损伤内膜中性粒细胞计数： 切取内膜损伤处血管约1.5 cm经4%甲醛液固定，石蜡包埋切片，HE染色，高倍镜（10×40）下取内膜下及中膜3点、6点、9点、12点位置，记数中性粒细胞总数，取平均值。分别观察24 h及14 d三组的内膜中性粒细胞计数。

（2）血管内膜厚度及内径的测定： 将损伤血管平均切取三段，HE染色后，于高倍镜下测定内膜厚度及内径，取三段的平均值。分别观察14 d三组的血管内膜厚度及内径。

（3）内膜VEGF蛋白表达： 将受损局部血管经4% 甲醛液固定，石蜡包埋切片，行ABC法VEGF免疫组织化学染色，观察VEGF蛋白表达量。分别观察24 h及14 d三组的VEGF蛋白表达量。

4.统计学分析 利用SAS统计软件作统计处理，计量资料以（-±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.损伤内膜的内皮化程度 扫描电镜观察，大鼠动脉拉伤后24 h，基因组血管内膜表面较粗糙，有较多白细胞和红细胞黏附，手术对照组血管内膜表面粗糙，有大量的白细胞和红细胞黏附并可见血小板毯状聚集和微血栓形成。而正常血管内膜表面光滑，内皮细胞形状规则，呈梭形，沿血流方向排列。动脉拉伤14 d后，基因组血管内膜内皮细胞呈岛状分布，形状较正常内皮细胞饱满，处于增殖活跃期，血管内膜较手术对照组光滑。

2.血管内膜厚度的测定 注射后24 h，基因组和手术对照组内膜厚度均增加，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；14 d，基因组内膜厚度较手术对照组明显减小（P＜0.01），管腔内径较手术对照组明显增大（P＜0.05）。见表1。典型图片见封四图1～3。

3.损伤内膜VEGF蛋白表达 24 h后基因组中内膜处可见极少量VEGF阳性反应的棕褐色颗粒，与手术对照组少量的阳性反应的棕褐色颗粒无明显差异。14 d基因组中内膜处可见大量VEGF阳性反应的棕褐色颗粒，手术对照组仅见少量的阳性反应的棕褐色颗粒。典型图片见封四图4～5。

4.中性粒细胞浸润情况 24 h后基因组损伤血管内膜中性粒细胞计数显著低于手术对照组（P＜0.05）；14 d后各组中白细胞浸润均较少，各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

讨论

近来研究发现，经皮冠状动脉腔内血管成形（PTCA）术后再狭窄是涉及炎症反应，基质沉积，血管平滑肌细胞过度增殖及血管重塑等多因素，多环节复杂过程，但70%以上的管腔丧失是由于血管重塑所致［1］，从而严重限制了PTCA的临床应用。我们的实验发现，14 d后手术对照组内膜厚度较基因组明显增加（P＜0.01），管腔内径也较基因组明显缩小（P＜0.05），与正常对照组比较差异更显著（P＜0.01），说明了血管内膜损伤后存在着血管狭窄性重塑的危害性，如何防止血管内膜增厚所致的血管重塑性狭窄，仍是亟待解决的问题。研究发现，内皮细胞损伤是内膜增厚、血管重塑的始动因素［2，3］，正常的血管内膜，小量的内皮细胞损伤恢复很快，大约在48 h内即开始，7～14 d完全恢复正常。然而，当内膜损伤较大时，即已经被修复的增殖平滑肌细胞和细胞外基质堆积，使内膜增厚，出现血管狭窄，血管内膜内皮层的完整性对保持血管壁的正常结构和功能极其重要，并与血管狭窄密切相关，内皮细胞损伤面积决定着新生内膜增厚的程度，内皮细胞最后覆盖区内膜增生最厚，损伤后内皮化速度对最终形成再狭窄有关键作用［4］。研究发现VEGF可以刺激内皮细胞产生NO和PGI2，而NO和PGI2有对抗血管平滑肌细胞（SMC）分裂作用。Laitinen等人发现血管外的VEGF可以明显地抑制新生内膜平滑肌的过度增生，保护内皮细胞的完整性［5］。因此，应用内皮细胞丝裂原VEGF，促进损伤内膜的内皮化，是防止血管再狭窄的新策略。

由于血管内皮生长因子蛋白制品半衰期较短（

参考文献

［1］Geary RL,Nikkari ST,Wagner WD,et al.Wound healing: a paradigm for lumen narrowing after arterial reconstruction［J］.JVasc Surg,1998, 27（1）：106-108.

［2］Laitinen M,Hartikainen J,Hiltunen MO,et al.Catheter-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer to human coronary arteries after angioplasty［J］.Hum Gene Ther,2000,11(2):263-270.

［3］Tübler T,Schlüter M,Dirsch O,et al.Balloon-protected carotid artery stenting: relationship of periprocedural neurological complications with the size of particulate debris［J］.Circulation,2001,104（23）:2791-2796.

［4］成业东，肖建如，方 平，等.VEGF165基因联合抗细胞间黏附分子-1单克隆抗体对内膜损伤后血管重塑的影响［J］.第二军医大学学报，2006，27（9）：1020-1022.

［5］Laitinen M,Zachary I,Breier G,et al.VEGF gene transfer reduces intimal thickening via increased production of nitic oxide in carotid arteries［J］.Hum Gene Ther,1997,8（15）： 1737-1744.

(收稿日期：2011-06-01 修回日期：2011-07-15)

(编辑：梁明佩 英文审校：程家惠）