补阳还五汤苷类有效组分及其有效成分配伍对血管平滑肌细胞增殖及相关信号转导通路的影响
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[摘要]研究补阳还五汤苷类有效组分和其主要有效成分黄芪甲苷、苦杏仁苷、芍药苷及其配伍抗血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的作用，阐明其抗VSMC增殖的主要药效物质，并从细胞信号转导途径研究其作用机制。大鼠口服给药后制备含药血浆。培养大鼠主动脉VSMC，采用血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）刺激VSMC增殖，加入含药血浆，测定细胞增殖活性、细胞周期及其相关蛋白表达、细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、Janus激酶/信号转导与激活因子（Janus kinase /signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路相关蛋白表达。结果显示，PDGF刺激后，VSMC增殖活性增强（P
[关键词]补阳还五汤；苷类有效组分；黄芪甲苷；苦杏仁苷；芍药苷；血管平滑肌细胞增殖；细胞周期
[Abstract]This paper was aimed to explore the effects of glycosides， the effective component of Buyang Huanwu decoction， and its main active components such as astragaloside Ⅳ， amygdalin， peoniflorin and their combinations on vascular smooth muscle cells （VSMC） proliferation， clarify the major active materials of antiVSMC proliferation and investigate the mechanisms via the signal transduction pathway Plasma containing drug was prepared via oral administration in rats VSMCs of rats aorta were cultured， and then VSMC proliferation was stimulated by using platelet derived growth factor （PDGF）The plasma containing drug was added to detect the activity of cell proliferation， cell cycle and related protein expressions of signaling pathway such as extracellular signalregulated kinase （ERK）， phosphatidylinositol3kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） and Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） After being stimulated by PDGF， the proliferation activity of VSMC was strengthened （P
[Key words]Buyang Huanwu decoction； glycosides； astragaloside Ⅳ； amygdalin； peoniflorin； vascular smooth muscle cell； cell cycle
doi：10.4268/cjcmm20161022
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖是动脉粥样硬化、经皮冠状动脉血管成形术后再狭窄等血管增殖性病变的共同病理基础。当动脉血管内皮细胞损伤后，使VSMC发生表型转化、增殖，从而导致血管内膜增生，是导致血管再狭窄的重要原因[1]。因此，抑制VSMC异常增殖，是防治血管增殖性病变的重要手段。虽然近年来球囊扩张、支架植入等技术广泛应用于冠状动脉狭窄的治疗，但术后再狭窄率仍然较高，并存在一定的副作用[2]。VSMC增殖的原因相当复杂，应当从多个环节进行干预，才能有效地阻抑VSMC的异常增殖。中医药具有多环节、多靶点的综合调节作用，可对疾病进行多方面的调整，这与VSMC异常增殖的病理机制相符合。因此，从中医药中寻找有效的抗VSMC增殖的方法和药物，将可能具有重要的前景。
以往的研究表明，在大鼠血管内膜损伤再狭窄模型，补阳还五汤（Buyang Huanwu decoction，BHD）及其苷类有效组分可抑制VSMC向血管内膜的迁移和增殖，阻抑细胞外基质蛋白的合成，从而发挥其抗血管内膜增生的作用[3]。进而以VSMC体外增殖模型研究发现，该方的苷类有效组分可抑制PDGF诱导的VSMC增殖，其作用机制与抑制细胞周期转换有关[4]。为进一步明确该方苷类有效组分中抗VSMC增殖的药效成分及其机制，本研究采用VSMC增殖模型，从细胞增殖研究了该方苷类有效组分和其主要有效成分及其配伍抗VSMC增殖的效应，并从相关细胞信号转导通路研究了其作用机制。
1材料与方法
11细胞
细胞株A10细胞来自大鼠主动脉的VSMC，购自美国模式培养物收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），ATCC编号CRL1476。
12试剂
血小板衍生生长因子BB（plateletderived growth factorBB，PDGFBB）购自Sigma（批号1001209155）。碘化丙啶（propidium iodide，PI）（批号602131），聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX100）（批号T8200）均购自Solarbio。DMEM 高糖培养基，025%胰蛋白酶溶液，胎牛血清（fetal calf serum，FCS）均为Hyclone产品。01 mol・L-1 pH 74磷酸盐缓冲溶液（PBS）为Biosharp产品。抗淬灭封片剂（批号10A06A09）购自BOSTER 公司。有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）特异性抑制剂PD98059（批号S1805），磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路抑制剂Ly29400（批号S1737），Janus 激酶/信号转导与激活因子（Janus kinase /signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路抑制剂AG490（批号S1509）均购自Beyotime。一抗抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（批号20120911），抗细胞周期素D1（cyclin D1）抗体（批号20121009），抗PI3K抗体（批号sc1637），抗STAT3抗体（批号sc8019），抗磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（phosphorylated extracellular signalregulated kinase 1/2，pERK1/2）抗体（批号sc101759）均为小鼠抗大鼠单克隆抗体，购自Santa Cruz公司。二抗为FITC标记的羊抗小鼠抗体用于PCNA，cyclin D1，PI3K，STAT3，pERK1/2的测定，以上二抗均购自BOSTER公司。一抗抗磷酸化PI3K（pPI3K）抗体（批号sc6254），抗磷酸化STAT3 （pSTAT3）抗体（批号sc16566）均为兔抗大鼠单克隆抗体，购自Santa Cruz公司。二抗为Cy3标记的羊抗兔抗体用于pPI3K，pSTAT3的测定，以上二抗均购自BOSTER 公司。
13药物
补阳还五汤由黄芪60 g、当归9 g、赤芍9 g、川芎6 g、地龙9 g、红花9 g、桃仁9 g组成，由湖南中医药大学药学院药剂教研室按照水煎醇沉法提取，生药浓度111 g・mL-1。苷类有效组分为用原方提取液再采用酸碱沉淀和离子交换树脂色谱等方法提取而成[4]。以HPLC测定苷类有效组分中的黄芪甲苷、苦杏仁苷、芍药苷质量分数分别为3798，548，1036 mg・g-1。
黄芪甲苷（批号MUST12102706），苦杏仁苷（批号MUST12011801），芍药苷（批号MUST12113009）购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%。阿托伐他汀（atorvastatin）商品名立普妥，Pfizer Lreland Pharmaceuticals生产，批号018312K。
14含药血浆的制备
60只SPF级SD大鼠随机分为空白组、苷类组分组、黄芪甲苷组、苦杏仁苷组、芍药苷组、3个有效成分合用组、阿托伐他汀组，每组动物8～9只，雌雄各半。适应性喂养后灌胃给药，给药剂量为空白组给予等量蒸馏水（10 mL・kg-1），苷类组分组25 g・kg-1，黄芪甲苷组95 mg・kg-1，苦杏仁苷组22 mg・kg-1，芍药苷组258 mg・kg-1，阿托伐他丁组20 mg・kg-1，3个有效成分合用组为黄芪甲苷95 mg・kg-1+苦杏仁苷22 mg・kg-1+芍药苷258 mg・kg-1。以上药物以5%羧甲基纤维素钠溶液配成混悬液按等体积灌胃。每天分别于9：00和16：00给药2次，连续灌胃7次，末次给药后2 h，以10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以15% EDEANa2（血液抗凝剂9∶1）抗凝，3 000 r・min-1离心15 min，取上层血浆。将各组动物血浆等量混合即得含药血浆。各含药血浆用022 μm滤器过滤除菌后分装，于-70 ℃保存备用[4]。
15各含药血浆对PDGF诱导的VSMC增殖的量效关系
用MTT法测定。实验用VSMC传代细胞5代以内，分成无血浆空白对照组、PDGF刺激组、不同浓度含药血浆（1%～15%）组。细胞接种于96孔细胞培养板，贴壁后换用无血清培养基培养24 h，使细胞同步化于G0期。然后分别加入不同浓度的含药血浆，作用3 h后加入PDGFBB（终浓度10 μg・L-1）。培养24 h后，加入MTT（5 g・L-1）20 μL，4 h后倾去培养液加入二甲基亚砜（DMSO）200 μL，振荡10 min后测定490 nm处吸光度（A）。以含药血浆浓度为自变量，以A为因变量制作浓度效应曲线，分析不同浓度含药血浆对VSMC增殖的抑制效应，并计算抑制率：抑制率（IR）=（APDGF组-A含药血浆组）/（APDGF组-A空白血浆组）×100%。最后，以含药血浆浓度为自变量，抑制率为因变量进行回归分析，计算出各含药血浆的半数抑制浓度（IC50）。
16各含药血浆抑制PDGF诱导的VSMC增殖的时效关系
实验分为无血浆空白对照组、PDGF刺激组、空白血浆组、苷含药血浆组、黄芪甲苷含药血浆组、苦杏仁苷含药血浆组、芍药苷含药血浆组、阿托伐他汀含药血浆组、3个有效成分合用血浆组共9组，各含药血浆的终浓度均为10%。同上培养细胞并同步化于G0期。然后无血浆空白对照组加200 μL培养液、PDGFBB刺激组加180 μL培养液，3 h后加入PDGFBB 20 μL（终浓度10 μg・L-1）。其余各含药血浆组加入160 μL培养液、20 μL含药血浆，3 h后加入PDGFBB 20 μL。37 ℃，5%CO2继续培养。于12，24，48 h分别加入MTT 20 μL/孔，37 ℃，5%CO2孵育4 h后，同上测定490 nm处的A，以A反映细胞增殖活性。
17VSMC细胞周期测定
实验分组同16项。细胞同前培养并同步化于G0期，再分别加入终浓度为10%的各含药血浆，作用3 h后加入终浓度为10 μg・L-1的PDGFBB，作用24 h后用流式细胞分选术测定细胞周期各期细胞数，计算细胞周期各期细胞的百分比。G0/G1期代表静止期细胞，S期和G2/M期代表分裂增殖期细胞。
18细胞周期相关蛋白PCNA，cyclin D1测定
实验分12组：无血浆空白对照组、PDGF刺激组、空白血浆组、苷含药血浆组、黄芪甲苷含药血浆组、苦杏仁苷含药血浆组、芍药苷含药血浆组、3个有效成分合用含药血浆组、阿托伐他汀组、PD98059组、AG490组、Ly294009组。细胞培养同前，然后3个抑制剂组分别加入PD98059（终浓度50 μmol・L-1）、AG490（终浓度50 μmol・L-1）、Ly294009（终浓度50 μmol・L-1），其余各组分别加入各含药血浆（终浓度10%）。再于3 h后加入终浓度10 μg・L-1的PDGFBB，培养24 h用于测定细胞周期相关蛋白。将细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，PBS漂洗3次。加05% TritonX100穿孔3 min。再以PBS漂洗3次后，以5% BSA封闭。然后加入1% BSA稀释的PCNA，cyclin D1一抗（均1∶200），于4 ℃过夜，PBS漂洗3次后，加入1% BSA稀释的二抗（1∶50），于室温避光温育30 min。以PBS漂洗后，加入Hoechst33258（1∶500）染色。抗淬灭封片剂封片。用激光共聚焦显微镜（奥林巴斯CSC6F24407，日本）测定，以平均荧光强度值反映PCNA，cyclin D1蛋白的表达强度。
19MAPK，PI3K/Akt，JAK/STAT信号转导通路相关蛋白表达的测定
实验分10组：无血浆空白对照组、PDGF刺激组、空白血浆组、苷含药血浆组、黄芪甲苷含药血浆组、苦杏仁苷含药血浆组、芍药苷含药血浆组、3个有效成分合用含药血浆组、阿托伐他汀组、PD98059组或AG490组或Ly294009组。细胞培养同前，然后抑制剂组分别加入PD98059或AG490或Ly294009，其余各组分别加入各含药血浆（终浓度10%），再于3 h后加入PDGFBB，培养24 h后同上用激光共聚焦显微镜测定，一抗均以1∶200稀释，以平均荧光强度值反映蛋白的表达强度。
110统计学分析
运用SPSS 170统计学软件分析。实验结果均采用±s表示。各组间均数比较用单因素方差分析。组间两两比较，方差齐者用LSD检验，方差不齐者则用Dunnet T3检验。以P
2结果
21不同浓度含药血浆对VSMC增殖的抑制作用
各含药血浆在浓度为10%时，与空白血浆比较，可显著抑制VSMC增殖（P
逐渐增强，尤以PDGF刺激组细胞增值活性最强，在12～48 h增殖活性显著高于无血浆空白对照组（P
23各含药血浆对VSMC细胞周期的影响
与无血浆空白对照组比较，PDGF刺激组G0/G1期细胞显著减少（P
24各含药血浆对细胞周期相关蛋白PCNA，cyclin D1表达的影响
与无血浆空白对照组比较，PDGF刺激组PCNA，cyclin D1表达显著增强（均P
25各含药血浆对相关信号转导通路的影响
251对pERK1/2蛋白表达影响与无血浆空白对照组比较，PDGF刺激组pERK1/2表达显著增高（P
252对PI3K蛋白表达的影响与无血浆空白对照组比较，PDGF刺激组PI3K表达显著降低（P
253对STAT3蛋白表达的影响与无血浆空白对照组比较，PDGF刺激组STAT3表达显著降低（P
3讨论
动脉内膜损伤导致VSMC在受损部位的异常增殖是血管增殖性疾病发生的主要因素。在大鼠动脉内膜损伤后实验发现，损伤后几小时内即有VSMC增殖现象的发生，从第4天开始增殖的VSMC向损伤血管内膜处移行，2周后VSMC增加了近5倍，移行并增殖的细胞占据了内膜细胞总数的90%[5]。细胞周期的激活反映了细胞的有丝分裂和增殖[6]。细胞周期分为4个不同的阶段：G1期、S期、G2期、M期，且存在2个限制点决定了细胞是否继续增殖或进入静止状态：一是G1/S转换点，二是G2/M转换点。G1/S转换点决定了细胞从静止状态（G1期）进入DNA 合成期（S 期）[7]；G2/M转换点则是决定细胞是否可顺利进行有丝分裂的关键因素[8]，其中G1/S转换点为增殖细胞唯一能够接受外界增殖或抑制信息的调控点。
细胞周期的顺利进行还受细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期素依赖性激酶（cyclindependent kinase，CDK）的精密调控，它决定了细胞能否进出细胞周期[9]。cyclin是调控细胞周期的重要因素之一，它作用于细胞周期的不同阶段，导致细胞分裂、增殖，使细胞周期得到促进或者抑制，可加速或延缓细胞周期进程[10]。在cyclin家族中，其中对细胞周期的调控最为重要的是cyclin D亚家族。cyclin D有3个亚型，分别是cyclin D1，D2，D3。cyclin D1既是细胞周期最早合成的蛋白，也是细胞周期G1期的特异性表达蛋白，通过加速G1期的进程而缩短细胞周期。PCNA是与细胞增殖相关的一种蛋白，它可参与细胞DNA的合成过程，是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，是细胞到达S期所必需的一种蛋白。PCNA于细胞周期G1晚期出现，到S期达高峰，G2期表达下降，M期及G0期则无表达，它特异性表达于S期[11]。因此，PCNA的表达和细胞的增殖、分化有关，是反映细胞增殖的敏感指标。细胞PCNA的表达水平与细胞增殖的程度成正相关[12]。
本研究表明，PDGF可引起VSMC增殖，使细胞周期转换加快，细胞周期相关蛋白PCNA，cyclin D1表达增加。空白血浆对VSMC增殖具有轻微的抑制作用，这可能是在制备血浆过程中，抗凝剂EDTA对细胞的生长具有一定的抑制作用，可在一定程度上抑制VSMC的增殖。BHD苷类有效组分和其主要有效成分黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷及其配伍具有抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用，效应呈剂量效应关系和时效关系。细胞周期及其相关蛋白测定也表明，苷类有效组分和其主要有效成分黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷及其配伍可使G0/G1期细胞增多，S/M期细胞减少，PCNA，cyclin D1蛋白表达下调。黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷配伍抑制VSMC增殖的作用强于单个有效成分的作用。结果提示，苷类有效组分是BHD抗VSMC增殖的主要药效物质，黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷为BHD苷类有效组分中抗VSMC增殖的主要药效物质，提示三者配伍具有增强抑制VSMC增殖的作用。其作用可能是通过下调细胞周期相关蛋白的表达，从而延缓细胞周期的进程而发挥抗VSMC增殖的作用。
生长因子、细胞因子、血管活性物质等作用于相应受体后所产生的效应可由多条信号途径传入细胞内，并通过诱导细胞周期蛋白基因表达而启动细胞增殖。其中主要有丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK），PI3K/Akt，JAK/STAT信号通路参与了VSMC增殖。MAPK是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与胞外信号经细胞表面传递到胞内的过程，是多种胞外信号引起细胞增殖的胞内信号传递的汇聚点和胞内信号转导的共同道路。在刺激因子作用下，通过多种细胞外信号机制，最后使MAPK激活，促进了VSMC增殖。生长因子和细胞因子刺激VSMC增殖主要由ERK介导，它们通过ERK共同途径发挥作用，ERK是把胞外信号转导到核内调控基因表达的重要的胞内信号分子，是不同促增殖因子调控的共同通路[13]。实验表明，球囊损伤后可引起ERK活化。下调ERK1和ERK2的活性，可抑制VSMC增殖，从而抑制球囊损伤所致的血管内膜增生[14]。
PI3K/Akt信号通路是细胞内的重要信号传导途径，具有广泛的细胞调节功能，在细胞增殖分化、糖代谢、胰岛素分泌及其信号转导中发挥着重要作用[15]。PI3K能将信号进行传递，使细胞周期蛋白合成增加，从而促进G1期的进展，使细胞周期变短。生长因子、细胞因子、激素、缺氧等细胞外信号刺激可激活PI3K，从而引起细胞增殖和活化。
JAK/STAT 信号传导通路由STAT14，STAT 5a，STAT 5b，STAT6等7个成员组成，代表一条从膜到核的信号传导系统，是由受体酪氨酸激酶信号转导子与转录活化子靶基因的激活来实现的，可以介导细胞因子、生长因子与其受体结合后的信号蛋白分子级联活化反应[16]。JAK与生长因子、细胞受体结合后，选择性地激活其底物STAT，使其转位到细胞核，作用于cyclin D1，cmyc，p21等下游靶基因，调节细胞增殖、分化和凋亡。在JAK/STAT信号通路中，与VSMC增殖密切相关的主要为JAK2，STAT1，STAT3。PDGF作用于VSMC后，可促进JAK2和STAT3的酪氨酸磷酸化。用JAK2抑制剂AG490处理后，可降低由PDGF诱导的VSMC增殖、迁移。实验表明，血管紧张素1型受体拮抗剂抑制血管损伤后内膜增生与其抑制ERK，STAT1，STAT3信号途径有关，表明STAT信号家族参与血管新生内膜的形成[1718]。Shibata[19]证实VSMC中，STAT3通过直接促进早期反应基因的转录激活，从而调控增殖信号的传递。而在大鼠颈动脉球囊损伤后早期即出现JAK2和STAT3的诱导性增高，并在手术后7 d达高峰，表明由STAT介导的信号通路通过增加VSMC的增殖促进血管内膜新生。在阻断ERK1/2通路后可抑制STAT3酪氨酸磷酸化，表明ERK是JAK/STAT通路的上游激酶，与JAK/STAT通路之间存在交互作用[20]。
本研究表明，PDGF诱导VSMC增殖后，pERK1/2表达增强，表明MAPK信号通路激活。PI3K表达降低，pPI3K表达增强，表明PI3K被激活，磷酸化PI3K生成增加，从而使PI3K信号通路活化。STAT3表达降低，pSTAT3表达增高，表明磷酸化STAT3生成增加，JAK/STAT信号途径激活。提示PDGF诱导VSMC增殖的机制与MAPK，PI3K/Akt，JAK/STAT信号转导途径激活有关，PDGF可诱导血管平滑肌细胞ERK1/2，PI3K和STAT3蛋白磷酸化，促进了VSMC细胞周期转换和增殖。苷类有效组分可抑制pERK1/2表达的增强；使PI3K表达升高，pPI3K表达降低；可抑制STAT3表达的降低，使pSTAT3表达降低。其主要有效成分黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷及其合用也具有上述相同的作用。因此，本研究结果提示，BHD苷类有效组分抗VSMC增殖、抑制细胞周期转换的作用机制与其抑制PI3K/Akt，MAPK，JAK/STAT 3个信号通路激活有关，苷类有效组分和其有效成分及其配伍可能通过抑制ERK1/2，PI3K，STAT3蛋白磷酸化，抑制了PI3K/Akt，MAPK，JAK/STAT 3个信号通路的激活，从而抑制了VSMC增殖。其主要有效成分黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷为其抗VSMC增殖、抑制PI3K/Akt，MAPK，JAK/STAT信号通路激活的主要有效成分，三者配伍对VSMC增殖的抑制具有增强作用。
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