生物测定法用于中药质量评价的探索研究
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[摘要]研究不同来源及不同部位夏枯草的抗氧化活性，并对其所含原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸5种酚酸类成分含量进行测定，探讨夏枯草抗氧化活性与总酚酸含量间的相关性，为制定科学合理的质量标准服务。以夏枯草50%甲醇提取液为研究对象，分别采用DPPH和HPLC测定夏枯草的抗氧化活性及原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸5种酚酸类成分的含量。DPPH采用夏枯草50%甲醇提取液05 mL与01 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液反应60 min，于5.1.7 nm波长处测定吸光度，用清除率及IC50进行抗氧化活性评价。HPLC采用Epic C1.8色谱柱，乙腈01%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，2.80 nm进行检测。采用偏最小二乘法对多批不同产地和不同部位夏枯草的抗氧化能力与其中5种酚酸类成分的总含量间的相关性进行分析。夏枯草50%甲醇提取液与01 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液反应的量效范围为0300～1.65 g・L-1（药材），原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸的进样量分别在0007 84～0980，001.1 5～1.4.4，0008 64～108，0080 0～100，0079 8～0998 μg与各自峰面积积分值成良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率分别为9776%，9688%，1003%，102.1%，104.5%，RSD分别为1.8%，1.6%，1.7%，062%，075%。夏枯草各部位的抗氧化能力与总酚酸含量和在一定的药材质量范围内具有良好的线性相关性。因此，在确定的药材质量范围内，采用DPPH生物测定法结合HPLC含量测定法共同用于夏枯草药材的质量控制，可考虑作为一种新的尝试用于夏枯草质量标准的修订。
[关键词]中药质量评价新模式； 夏枯草； 抗氧化活性； DPPH・（1，1二苯基2三硝基苦肼）； 总酚酸含量； HPLC； 偏最小二乘法
夏枯草为唇形科夏枯草属夏枯草Prunella vulgaris L的干燥果穗，是我国传统中药之一。具有清肝泻火，明目，散结消肿之功效，临床多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病[1]。现代研究证明，夏枯草具有清除体内自由基[2]，延缓衰老等功效，是王老吉凉茶“去火”的主要食材。夏枯草中含有的咖啡酸、迷迭香酸、芦丁、槲皮素等成分为夏枯草的重要活性成分[3]。随着大健康产业的发展，市场对夏枯草需求大幅度增长，尽管已经建立了大量的规范化种植基地，仍难以满足市场的巨大需求，一些不法企业在夏枯草的原料中非法添加其他药用部位或以次充好的现象屡见不鲜，严重危及夏枯草相关产品的质量和安全。目前，夏枯草的质量评价多以咖啡酸和迷迭香酸为检测指标，采用HPLC进行测定，这些成分在唇形科的很多植物中都普遍存在，而对夏枯草果穗中的特征性成分异迷迭香酸苷[4]研究较少。本研究针对与夏枯草功效具有较好相关性的抗氧化活性为检测指标， 同时辅以HPLC同步测定其原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸5种代表性酚酸类成分含量，并采用偏最小二乘法将夏枯草的抗氧化活性与这5种酚酸含量和（以下简称：总酚酸）进行相关性分析，探讨将生物测定法与成分含量测定法相结合，在药效和含量方面综合评价夏枯草药材质量的可行性，以全面提高夏枯草的质量控制水平。
1材料
1.1仪器
Ultra3.400型紫外可见分光光度计（北京普源精电科技有限公司）； KQ2.50DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS205 型1/10万天平（瑞士，梅特勒托利多仪器有限公司）；LD4.2A型离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；DK981 型电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；Waters Alliance高效液相色谱仪，Empower3色谱工作站（美国，沃特世公司）。
1.2试剂
DPPH试剂（Alfa Aesar公司，Lot：D1.9Y02.9）；甲酸（GR，北京化工试剂公司）；95%乙醇（北京化工试剂公司）；甲醇（HPLC级，美国Fisher公司）；乙腈（HPLC级，美国Fisher公司）；娃哈哈纯净水。
1.3试药
对照品迷迭香酸（批号 1.11.871.201001，含量以988%计），原儿茶醛（批号 1.10810200506），原儿茶酸（批号 8099201），咖啡酸（批号 1.10885.200102），上述对照品均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用；异迷迭香酸苷对照品由湖南中医药大学林丽美教授提供，经HPLC法测定，含量大于98%；夏枯草药材均经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定，来源于唇形科植物夏枯草P vulgaris的不同部位，见表1。
2方法与结果
2.1DPPH法测定夏枯草的抗氧化活性
DPPH・是一种稳定易得的有机氮自由基，具3个芳环结构，属于芳香类自由基[5]，DPPH・有机溶液呈紫色，在波长为5.1.5～5.2.8 nm处具有特征吸收光谱。当自由基清除剂与DPPH・相遇时，DPPH・自由基中的孤对电子被配对，DPPH・自身的紫色被还原为黄色DPPHH的非自由基形式，在5.1.7 nm 波长处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度成线性关系，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度减小。
本研究在结果的判定方面，使用IC50（半数抑制率）或DPPH・清除率表示抗氧化能力。
2.1.1溶液的制备DPPH・乙醇溶液： 分别精密称取DPPH粉末1.97，3.94，5.91 mg至100 mL量瓶中，加80 mL 95%乙醇，超声30 min，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，分别制成0050，010，01.5 mmol・L-1的DPPH・乙醇溶液，即得。避光，备用。
夏枯草样品溶液： ①供方法学考察，取夏枯草粉末（过40目）约01.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇溶液，称定质量，置沸水浴中，加热回流30 min，取出，放冷，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，置50 mL离心管中，离心（4 000 r・min-1）10 min，取出，取上清液，作为夏枯草储备液，质量浓度[ 3 g・L-1（药材）]。分别精密吸取夏枯草储备液4.5，40，30，2.75，2.5，2.2.5，20，1.75，1.5，1.2.5，10，075，05 mL置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为2.70，2.40，1.80，1.65，1.50，1.3.5，1.2，105，090，0750，0600，04.50，0300 g・L-1（药材）的夏枯草50%甲醇溶液，备用。②供活性测定，分别取不同体积的夏枯草储备液，置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，制成药材质量浓度分别为1.8，1.65，1.5，1.2，09，06，03 g・L-1（药材）的夏枯草果穗50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为1.8，1.5，1.3.5，1.2，09，06，03 g・L-1（药材）的夏枯草穗50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为06，1.2，1.8，2.4，30，3.6，4.2 g ・L-1（药材）的夏枯草种子50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为03，06，09，1.2，1.3.5，1.5 g・L-1（药材）的夏枯草根50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为03，06，09，1.2，1.5，1.8 g・L-1（药材）的夏枯草茎50%甲醇提取液和药材质量浓度分别为01.5，03，04.5，06，075，09，105，1.2 g・L-1（药材）的夏枯草叶50%甲醇提取液，备用。③空白样品溶液，取3 mL 95%乙醇与05 mL 50%甲醇溶液，置5 mL刻度试管中，混匀，即得。
2.1.2测定方法取010 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液3 mL，置5 mL刻度试管中，分别加入不同浓度夏枯草样品溶液05 mL，摇匀，反应60 min后，置紫外可见分光光度计中，于5.1.7 nm波长处测定吸光度，计算清除率。以3 mL 95%乙醇与05 mL 50%甲醇溶液为空白组，以3 mL DPPH・乙醇溶液与05 mL 50%甲醇溶液为对照组。计算公式见下。
清除率=[1-（Ai-Aj）/ A0]×100%
其中，A0为对照组吸光度；Aj为空白组吸光度； Ai为样品组吸光度。
2.1.3方法学考察①检测波长的确定：分别取010 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液、夏枯草储备液及空白样品溶液，置紫外可见分光光度计中，于400～800 nm波长处进行全波长光谱扫描。测定结果显示，DPPH・乙醇溶液在5.1.7 nm波长处有特征吸收峰，夏枯草储备液和空白溶液在相应检测波长处无特征吸收峰。因此检测波长确定为5.1.7 nm。② DPPH・溶液的稳定性试验：取01 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液，避光放置，分别于配制后0，05，1，2，3，4，6，8，1.2，2.4 h测定吸光度，并计算RSD。结果显示，不同放置时间下吸光度较稳定，RSD 为076%，表明2.4 h内 01 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液的稳定性良好。③反应时间的确定：取不同浓度夏枯草50%甲醇溶液各05 mL，分别加入010 mmol・L-1 DPPH・乙醇溶液3 mL，混匀，置紫外可见分光光度计中，于5.1.7 nm检测波长处每隔5 min测定1次吸光度，共测定90 min，记录吸光度，计算RSD。结果显示，不同药材浓度的夏枯草50%甲醇溶液与DPPH・乙醇溶液反应60 min后吸光度的RSD
2.1.4抗氧化能力的测定分别取不同产地、不同部位的夏枯草，按2.1.1项下方法制备夏枯草50%甲醇溶液，按2.1.2项下方法试验，测定不同药材浓度下各溶液的吸光度，计算清除率及 IC50，见表3，图2，3。
2.2HPLC测定夏枯草中5种酚酸类成分的含量
2.2.1色谱条件色谱柱Epic C1.8 1.20A（4.6 mm×2.50 mm，5 μm）；流动相为为01%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱0～1.67 min，1% B，1.67～1.67 min，1%～1.2% B，1.67～5.84 min，1.2%～5.5% B；检测波长2.80 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL，见图4。
2.22供试品溶液的制备取夏枯草粉末（过40目筛）约05 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液2.5 mL，称定质量，置沸水浴中，加热回流90 min，取出，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用 04.5 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.3对照品溶液的制备分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸对照品098，1.4.4，108，100，101 mg，置2.5 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，制成混合对照品溶液（每1 mL中分别含原儿茶酸003.9 2 mg、原儿茶醛005.7 6 mg、咖啡酸004.3 2 mg、异迷迭香酸苷0040 0 mg和迷迭香酸003.9 9 mg），备用。
.2.4线性关系考察分别精密吸取2.2.3项下的混合对照品溶液 02，05，1，5，10，1.5，20 μL，按2.2.1项下色谱条件进样分析，测定原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸的峰面积。以对照品的进样量（μg） 为横坐标，各待测成分色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果显示， 5种酚酸类成分在各自的线性范围内，线性关系良好，见表4。
1原儿茶酸； 2原儿茶醛； 3咖啡酸； 4异迷迭香酸苷； 5迷迭香酸； A混合对照品； B夏枯草供试品溶液。
2.2.5精密度试验取2.22项下同一份夏枯草6#供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，于同一日内连续进样6次，进样量20 μL，测定供试品溶液中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸的峰面积，计算RSD。结果显示，上述各待测成分峰面积的RSD分别为05.6%，098%，071%，1.2%，074%，结果表明，仪器精密度良好。
2.2.6稳定性试验取同一批夏枯草6#供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，2，4，6，8，1.6，2.4 h进样20 μL，测定供试品溶液中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸的峰面积，计算RSD。结果显示，上述待测成分峰面积的RSD分别为10%，1.7%，1.1%，1.2%，064%，表明2.4 h内供试品溶液的稳定性较好。
2.2.7重复性试验取同一批夏枯草6#粉末约05 g，精密称定，按2.22项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，测定夏枯草中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸的峰面积，计算含量及RSD。结果显示，夏枯草中上述待测成分的平均质量分数分别为0020 1%，0007 03%，002.6 0%，01.5.2%，01.70%，RSD分别为04.3%，05.4%，1.2%，068%，1.4%。结果表明，该方法的重复性良好。
2.2.8加样回收试验取同一批已知含量的夏枯草6#粉末约 02.5 g，精密称定，平行6份，分别按供试品含量对照品大致（1∶1）的比例加入一定量的混合对照品溶液，按2.22项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，测定供试品溶液中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸的峰面积，并计算加样回收率及RSD。结果显示，上述5种成分的平均加样回收率分别为9776%，9688%，1003%，102.1%，104.5%，RSD分别为1.8%，1.6%，1.7%，062%，075%。表明该方法的准确度良好，见表5。
2.2.9含量测定取不同产地和不同部位的夏枯草，按2.22项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，测定夏枯草中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸的峰面积并计算含量。见表6。
2.3抗氧化能力与总酚酸含量相关性分析
在表3确定的各批夏枯草抗氧化量效范围内，将表6中的总酚酸含量进行相应折算，分别以夏枯草的总酚酸含量（μg）为横坐标，以夏枯草的抗氧化活性（清除率/%）为纵坐标，采用偏最小二乘法进行线性回归，计算相关系数。结果发现：在夏枯草抗氧化量效范围内，夏枯草总酚酸含量与其抗氧化活性间具有较好的相关性，见表7。
3讨论
3.1HPLC 含量测定试验中各条件的确定
在多成分同步含量测定的供试品溶液制备方法考察中，比较了不同提取溶媒（水、甲醇、乙醇）、不同溶媒浓度（2.5%，40%，50%，60%，75%甲醇）、不同溶媒用量（20，2.5，30，50 mL）、不同提取方法（冷浸、超声、回流）和不同提取时间（回流05，10，1.5， 20 h）对测定结果的影响，结果以50%甲醇2.5 mL为提取溶媒，加热回流提取30 min测得的原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸5种酚酸类成分的含量最高，故以此为供试品溶液制备方法。
3.2结果分析
从含量测定结果可以看到，夏枯草中的总酚酸含量主要以迷迭香酸和异迷迭香酸苷为主，其中异迷迭香酸苷是夏枯草的特征性成分，它的含量主要集中在果穗、穗和种子中，在这3个部位异迷迭香酸苷的含量分别占总酚酸的3.5%，2.4%，50%，其余部位不含或含量甚微。因此，201.5年版《中国药典》规定夏枯草以果穗入药是合理的，为保证用药安全有效，一些不法企业以带叶的果穗或整个地上部分等来代替夏枯草投料的现象应加以禁止。
通过对夏枯草的抗氧化活性与原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸5种酚酸类成分的总含量进行相关性分析可见：① 在夏枯草抗氧化反应的量效范围内，夏枯草50%甲醇提取液的抗氧化IC50与其总酚酸含量之间存在较好的线性相关性。② 对于不同产地的夏枯草，总酚酸较高的1#（05.87%）夏枯草的抗氧化活性[ IC50为092.2 g・L-1（药材）]并非最强；而抗氧化活性最强的5#夏枯草[IC50为02.97 g・L-1（药材）]，其总酚酸（01.4.8%）并非最高。③ 对于不同部位的夏枯草，总酚酸较高的7#种子（100%）其抗氧化活性[IC50为2.3.2.3 g・L-1（药材）]并非最强；而抗氧化活性最强的7#叶[IC50为03.97 g・L-1（药材）]其总酚酸（0686%）并非最高。
从以上3点可以看出，单纯从含量或从抗氧化活性上均无法准确评价夏枯草药材的真实质量。因此，在制定夏枯草药材的质量标准时，如果引入抗氧化IC50这一活性指标，采用抗氧化活性测定和总酚酸含量测定相结合的方法，则可以更如实地评价夏枯草药材的质量。
目前，在进行中药质量评价时常用的方法是指纹图谱结合多成分含量测定法，指纹图谱法重在定性，尽管信息量大，但是其概念相对模糊，而多指标质量评价虽然可对指纹图谱的模糊性加以改善，但也仅仅是针对少数指标性成分从量上对中药质量加以控制，因此急需引入新的质量评价方法以全面合理的评价中药质量[610]。将生物测定法引入中药的质量评价中，可以从药效上对目前中药的质量标准加以完善和提高。期望采用生物测定法与HPLC多组分含量测定法相结合，真正能从量效上对中药质量进行同步质量控制，最终成为新的中药质量评价模式。
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