川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定位及表达分析お
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[摘要]根据川牛膝基因组数据提供的基因序列合成特异性引物，利用常规PCR方法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆川牛膝ObgC（GeneBank登录号KU84.7910）全长cDNA序列，克隆获得2 2.2.6 bp全长coobgc序列，开放阅读框为1 81.8 bp，编码605个氨基酸序列，预测CoObgC蛋白相对分子质量为663.9 kDa，等电点pI 5.3.5，为稳定蛋白，并进行多重序列比对和构建系统进化树分析。以川牛膝actin为内参，采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）分析CoObgC基因在川牛膝根、茎、叶、花4种组织中表达特征，结果显示在叶片中表达丰度最高，其次为根、花、茎；构建pCABIA2.300CoObgC重组载体，利用农杆菌介导法在烟草中进行瞬时表达，激光扫描共聚焦显微镜观察显示川牛膝CoObgC定位于叶绿体。该研究为进一步解析Obg基因的结构和功能，开展川牛膝分子生物学研究奠定基础。
[关键词]川牛膝； ObgC； 基因克隆； 亚细胞定位； 表达分析
川牛膝Cyathula officinalis Kuan是苋科杯苋属植物药材，为川产道地大宗药材之一，以根茎入药，味甘，性寒；具有活血化瘀、利尿通淋、通利关节等功效[12]。川牛膝主要化学成分为生物碱、甾酮类和多糖类物质，其中杯苋甾酮[34]、牛膝多糖[56]药效研究较广。现代药理研究表明，川牛膝在抗炎、抗菌、抗生育、抗肿瘤、延缓衰老等方面有活性[7]。叶绿体是植物进行光合作用的场所，叶绿体的正常发育对药用植物生长、发育及次生代谢活性物质的形成至关重要，叶绿体基因的正常表达最终影响药材外观性状和根部活性物质的积累，对川牛膝药材品质形成具有重要意义。目前，从基因水平研究川牛膝生长发育、品质形成未见相关报道。
Obg（SpoOBassociated GTPbinding protein）蛋白是一类广泛存在于原核生物和真核生物的三磷酸鸟苷绑定蛋白，不仅为细菌生存所必需，在维持植物生长和叶绿体发育也是必不可少的。研究发现Obg在核糖体组装[8]、压力胁迫[9]、孢子形成[10]、细胞分化[11]等方面发挥重要作用。植物ObgC是由核编码而定位于叶绿体的鸟苷三磷酸酶，为叶绿体发育过程所需基础蛋白，促进叶绿体的正常发育形成。尽管研究表明ObgC蛋白在拟南芥[12]、水稻[13]、龙眼[14]等植物生长发育中作用关键，通过调节叶绿体RNA转录、核糖体成熟影响叶绿体发育，但ObgC在川牛膝中如何作用叶绿体形成、调节生长发育以及影响川牛膝药材品质形成等机制有待研究，为川牛膝分子生物学、药材品质研究奠定基础。
本研究旨在以川牛膝各组织为材料，利用PCR，RACE等克隆技术，获取CoObgC基因cDNA全长序列，并进行生物信息学分析，分析氨基酸同源性，构建系统进化树；将CoObgC基因与载体重组形成绿色荧光融合蛋白，确定ObgC功能作用区域；同时，应用qRTPCR方法分析CoObgC基因在不同组织中表达特异性。为进一步研究ObgC蛋白家族和该基因对川牛膝生长发育与品质形成机制研究奠定基础。
1材料
1.1样品
本实验所用川牛膝均于201.5年6月2.4日，采于四川省雅安市宝兴县蜂桶寨乡新康村，由四川农业大学杨瑞武教授鉴定为苋科植物川牛膝C officinalis，采集后冷藏于干冰，保存于-80 ℃冰箱备用。
1.2试剂
Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa公司）；First Strand cDNA Synthesis KitReverTra Aceα（TOYOBO公司）；RACE试剂盒（ThermoFisher公司）；KODFxNeO聚合酶（TOYOBO公司）；Taq酶购自宝生物公司；SsoFastEvaGreen超混合液（BioRad公司）；EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA公司）；所有限制性内切酶均购于北京NEB公司，各种引物均由成都擎科梓熙生物科技公司合成。其他相关生化试剂均为分析纯试剂。
1.3菌株及载体亚细胞定位载体
pCAMBIA2.3003.5SeGFP保存于四川农业大学生物技术系；大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌GV3.101感受态均购于北京博迈德生物科技公司。
2方法
2.1总RNA提取及cDNA合成
将-80 ℃保存的川牛膝组织取出，在液氮中充分研磨成粉末状，按照植物总RNA提取说明书提取川牛膝RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测RNA提取质量。以总RNA为模板，oligo（dT）为引物，按照逆转录使用说明，反转录合成川牛膝cDNA。
2.2CoObgC基因cDNA全长克隆
根据川牛膝基因组数据设计特异性引物3EF和6ER（表1），以川牛膝成熟叶RNA的逆转录产物为模板，通过PCR扩增获取目的片段，反应体系（50 μL）：50 μL cDNA，2.5 μL 2 ×PCR Buffer，10 μL dNTP （2 mmol・L-1），1.5 μL 10×引物（3EF，6ER），1 μL KODFxNeO，ddH2O补足50 μL。PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，5.8 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min 30 s，30个循环；68 ℃ 7 min。PCR产物回收后送测序。
根据前期序列测定结果，按照RACE使用说明设计特异性引物（表1），并按要求将RNA反转生成cDNA第1条链。3′RACE反应体系为（50 μL）：50 μL cDNA，2.5 μL 2 ×PCR Buffer，10 μL dNTP （2 mmol・L-1），1.5 μL 10×引物（6EF和AUAP），1 μL KODFxNeO，ddH2O补足50 μL；PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，5.8 ℃ 20 s，68 ℃ 40 s，30个循环，68 ℃ 7 min。根据前期序列拼接设计5′RACE引物（表1），按照其操作说明进行实验。
2.3CoObgC蛋白的生物信息学分析
引物序列设计均在Primer 30在线设计；运用GeneWise（http：//wwwebiacuk/Tools/psa/genewise/）分析基因组数据（未公布）经测定的基因序列在BLAST上进行同源序列比对；拼接后的全长基因序列利用ORF Finder （http：//wwwncbinlhnihgov/gorf/gorfhtml）查找开放阅读框，并通过ExPASy（http：//webexpasyorg/translate/）转换为氨基酸序列。利用ProtParam（http：//webexpasyorg/cgibin/protparam/protparam）在线预测蛋白质相对分子质量、理论等电点、蛋白质稳定性以及疏水性等性质；通过SOPMA（https：//npsaprabiibcpfr/）在线预测蛋白质二级结构，运用BLAST（http：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi）和SWISSMODEL（http：//wwwswissmodelexpasyorg/Interactive）分别预测蛋白质保守域和结构域三维建模；通过ClustalX和MEGA 5.1软件进行同源序列比对并通过氨基酸序列构建系统进化树。
2.4亚细胞定位
2.4.1载体构建根据CoObgC的全长cDNA序列拼接结果，在引物KpnIF和SpeIR（表1）上分别引入KpnⅠ和SpeⅠ 2个酶切位点，对全长cDNA序列进行扩增，并对PCR产物和pCAMBIA2.3003.5SeGFP载体双酶切，经连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定后提取重组质粒。
2.4.2烟草瞬时表达将构建完成的pCAMBIA2.300CoObgC重组载体转化农杆菌GV3.101，并对幼嫩本氏烟草叶片进行侵染，2.4 h后在激光扫描共聚焦显微镜下观察绿色荧光融合蛋白定位表达情况。
2.5qRTPCR检测
基因组织表达提取各新鲜样品总RNA，以Oligo（dT）为引物，按照First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Aceα逆转录方法合成cDNA。根据川牛膝基因组数据设计内参actin引物，经测序验证后设计βactin特异性引物actinF和actinR（表1）；依据全长cDNA序列设计CoObgC定量引物ObgCF和ObgCR（表1）。定量PCR反应体系为：2.5 μL 10×cDNA，上下游引物（10 μmol・L-1）各04 μL，2×Ssofast Eva Green 5 μL，dd H2O补足10 μL。反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，5.5 ℃ 5 s，3.9个循环；95 ℃ 10 s，65～95 ℃做溶解曲线分析，各温度以05 ℃上升，并停留5 s。每个试验样品设置3次重复，用2-ΔΔCt方法在BioRad CFX Manager V软件上进行分析，测定各组织基因表达量。
3结果与分析
3.1川牛膝ObgC基因全长cDNA序列克隆
通过GeneWise软件分析川牛膝基因组数据，获取ObgC基因外显子序列，并设计特异性引物；以川牛膝新鲜叶片为材料最终合成模板cDNA，通过TouchDown PCR扩增得到1条约600 bp条带，经BLAST同源序列比对为ObgC同源片段。根据前期序列测定结果设计4条特异性引物（6EF，GSP1，GSP2，GSP3），以AP为引物反转录总RNA，cDNA为模板通过TouchDown PCR扩增出3′RACE条带（图1，A）。按照5′RACE技术操作说明，第2次PCR扩增获得1条特异性条带（图1，B）。最后，设计cDNA全长引物，扩增获得CoObgC基因完整ORF序列（图1，C）。将测序结果在NCBI上序列分析和拼接，CoObgC基因cDNA序列总长为2 2.2.6 bp，包括1个1 81.8 bp的完整开放阅读框，编码605个氨基酸，5′非翻译区长度为1.6 bp，3′非翻译区3.92 bp（图2）。
3.2CoObgC的生物信息学分析
3.2.1氨基酸序列分析将克隆获得的CoObgC基因全长ORF序列通过DNAMAN软件分析得到氨基酸序列，在BLAST结果与甜菜同源性较高达78%，其次为龙眼72%、水稻69%。运用DNAMAN软件对甜菜（XP_0106663.871）、拟南芥（NP_1.973.5.8）、龙眼（AEP401.201）、烟草（XP_0095.882.80）
A1.3′RACE扩增片段，2验证PCR扩增片段；B5′RACE扩增片段；C全长ORF扩增片段。
以及水稻（NP_0010605.86）进行多序列比对，结果表明川牛膝ObgC序列与其他ObgC家族基因具有较高同源性。并将CoObgC序列BLAST分析其保守区域，分析结果显示CoObgC具有ObgC家族完整保守区域，分别为GTP/Mg2+绑定位点、I型转换区域、II型转换区域以及G1～5 box5个区域（图3），表明是完整的ObgC蛋白，属于Obg蛋白家族。
3.2.2理化性质分析通过ProtParam在线软件预测分析CoObgC蛋白理化性质，分析结果表明：蛋白（C292.7H4.5.88N82.6O91.4S1.3）由605氨基酸组成，负电荷氨基酸91个，正电荷氨基酸70个，总相对分子质量为663.9 kDa，理论等电点5.3.5，不稳定系数为3.2.71，为稳定蛋白质，平均亲水系数为-04.2.9。
3.2.3蛋白结构分析在SOPMA在线软件上分析，蛋白质二级结构主要以无规卷曲和α螺旋为主，分别占3.85.1%，3.2.5.6%，其次是1.95% β延伸链与94.2% β转角。通过SWISSMODEL在线分析建立三维结构模型图（图4），以嗜热细菌HB8结构模型，川牛膝ObgC与模板序列一致性4072%。
3.2.4CoObgC序列比对和系统进化树分析为确立CoObgC在不同物种间的进化关系，用氨基酸在NCBI选取其他物种序列，包括细菌、绿藻、胚生植物、单子叶以及双子叶植物，利用NJ法构建系统进化树（图5），分析物种间亲缘关系。以上5种类群明显聚为5类，而川牛膝CoObgC与双子叶藜科甜菜聚集在一起，遗传距离较近，其次为番茄、土豆、烟草等，再次为单子叶、细菌等物种，符合生物进化规律。
3.3亚细胞定位分析
以总RNA为模板，通过KpnIF和SpeIR引物PCR扩增目的片段，经酶切纯化，连接转化大肠感觉DH5α感受态，PCR鉴定单克隆菌落，扩大培养提取质粒酶切鉴定（图6），序列BLAST证明重组载体构建成功。
将正确重组质粒转化农杆菌GV3.101感受态，对幼嫩烟草叶片进行融合蛋白瞬时表达，观察CoObgC定位于叶绿体（图7），与Target1.1 Server预测结果一致。
3.4CoObgC基因组织表达分析
采用实时荧光定量的方法对川牛膝根、茎、叶、花各组织进行CoObgC基因表达差异分析。结果表明，在4种组织中均有表达（图8），其中叶片中表达量显著高于根、茎、花，证实CoObgC在叶绿体中行驶功能；其次是根、花、茎，但无叶绿体的根略高于含叶绿体的茎、花，CoObgC在川牛膝中可能还有其他功能。
4讨论
目前，Obg蛋白在细菌中的研究较为深入，而植物Obg研究主要集中在以拟南芥、水稻等模式植物以及其他少数物种。本研究以苋科药用植物川牛膝为材料，克隆得到2 2.2.6 bp全长cDNA序列，共编码605个氨基酸，生物信息学预测蛋白质质量为663.9 kDa，等电点pI 5.3.5，为亲水性稳定蛋白，三维建模
显示CoObgC与细菌Obg结构基本相似，但CoObgC氨基酸在4.80 ～ 504处较细菌多1.6个氨基酸，蛋白G结构域与OCT末端区域[15]存在多肽链联系，G结构域主要依赖GTP/GDP结合调节CoObgC蛋白折叠（消耗高能磷酸键），OCT区域可能参与（p）ppGpp压力信号过程[16]，高等植物中将2个与鸟苷酸高能磷酸键相关结构域串联，充分体现了高等植物关于Obg的进化意义，以及CoObgC蛋白各功能相关性和复杂性；至于CoObgC蛋白具体结构仍有待进一步挖掘和研究。在多重序列比对以及系统进化树分析中，发现CoObgC序列以及其他Obg序列相似性最高83%，体现Obg蛋白保守性较高，高保守性与序列差异共同体现了Obg蛋白在生物进化中的规律和意义。
前期，拟南芥ObgC蛋白亚细胞定位表明，利用原生质体获得融合蛋白呈点状定位在叶绿体，并证明AtObgC信号肽功能氨基酸序列在50个以上，主要是Obg折叠区作用点状荧光形成；同样，水稻OsObgC也定位于叶绿体[13]。本研究利用烟草瞬时表达发现CoObgC定位于叶绿体，绿色融合蛋白也成点状聚集，通过TargetP分析CoObgC（301.20）是信号定位的关键区域，与拟南芥研究结果基本相似。组织表达特异性分析发现，CoObgC表达量在叶片中最高，根、花、茎依次降低，这与该基因参与叶绿体发育过程相符合，与其他植物ObgC组织表达情况基本一致；而且CoObgC可能与ObgE[17]，AtObgC以及OsObgC存在功能相似性，主要依靠调节核糖体50S亚基成熟，进而作用叶绿体发育形成。有趣的是，
各物种Obg氨基酸序列登录号：大肠杆菌Escherichia coli（NP_4.1.7650）；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（NP_3.90670）；绿藻. Ostreococcus tauri（XP_0030782.2.1）；小立碗藓Physcomitrella patens（XP_001.75.1.788）；玉米Zea mays（DAA4.1.697）；高粱Sorghum bicolor（XP_002.4.61.1.74）；粟Setaria italic（XP_004.95.865.3）；水稻Oryza sativa （NP_0010605.86）；甜菜Beta vulgaris（XP_0106663.871）；拟南芥. Arabidopsis thaliana（NP_1.973.5.8）；龙眼（AEP401.201）；烟草（XP_0095.882.80）；马铃薯Solanum tuberosum （XP_0063.4.2.75.8）；番茄. Solanum lycopersicum（XP_0103.2.1.1.2.9）；油菜Brassica napus（CDY5.8104）；芜菁Brassica rapa（XP_0091.2.62.67）；梅Prunus mume（XP_0082.2.3.1.2.5）；苹果Malus domestica（XP_0083.4082.8）。
1重组质粒EcoR I酶切；2质粒pCAMBIA2.300的EcoR I酶切；Mmaker。
通道波长λ=4.88 nm，标尺Bar=50 μm。
川牛膝根（无叶绿体）表达量却高于花和茎（有叶绿体），ObgC蛋白在川牛膝根可能参与其他生命活动，如压力反应和叶绿体DNA复制。
川牛膝为川产道地大宗药材，主要集中于化学成分及药理研究，分子研究较为薄弱，本文首次对川牛膝进行ObgC基因克隆及表达研究，不仅为CoObgC基因结构和功能研究，更为川牛膝分子克隆以及代谢途径分子机制的阐释奠定基础。
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