孕鼠染铝对胎鼠脑皮质神经元的影响

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【摘要】 目的 探讨母体孕期染铝对胚胎脑神经发育的毒性作用。方法 4~5月龄SD大鼠，雌雄各30只，1:1合笼喂养，每天早晨查雌鼠阴栓，发现阴栓即进入实验（E0），将孕鼠随机平分为2组。染铝组：E0E18期间以AlCl3100 mg/（kg•d）灌胃,正常对照组：以等量蒸馏水灌胃。取孕鼠18 d胚胎，每只孕鼠任取其胚胎2只，每小组子代30只。常规石蜡切片，经神经元特异烯醇酶（Neuron specific enolase,NSE）免疫组化染色。分别对胎鼠皮质Par1区内椎体细胞层NSE免疫组化染色阳性反应细胞进行计数，并用细胞形态学计量方法测量阳性反应产物的平均光密度。结果 染铝组胎鼠NSE免疫组化染色阳性细胞均明显少于对照组胎鼠(P

【关键词】 孕期；铝；神经元；子代

The aluminium effect on neurons of embryo in aluminium exposure to pregnant rats

JIANG Dong，KANG Chaosheng.Department of Anatomy,Guiyang Medical University,Guiyang 550004,China

【Abstract】 Objective To investigate the developmental neurotoxicity of embryo in aluminum exposure to pregnant rats．Methods 30 male and 30 female SpragueDawley rats of 4~5 months age，the rats were mated，cheek up female rats,vaginal plug in the morning at every day，the day for discovering vaginal plug wss EO．Pregnant rats were randomly divided into two equal groups：the aluminum exposed group(pregnant rats were given A1C13 100 mg/(kg•d) by digestive tract from EO to El8)，and normal control group(pregnant rats were given equal distilled water)．After traditional parafin section preparation，the embryonal brain were stained immunohistoneactively，and NSEpositive cells were quantitatively analyzed with cell morphometric tehnique．Results The numbers of NSE positive cells in the internal pyramidal layer of Par1 were obliously decreased in aluminum exposed group than that of normal control group，their average opiticaloptical density were obviously lower， respectively．Conclusion The numbers of Neurons are decreased in aluminum exposure to pregnant rats，whichmaybe lead to developmental neurotoxicity．

【Key words】 Pregnant rats；Aluminium ；Neurons；Embryo

铝是环境中含量最丰富的元素之一。70年代以前，人们普遍认为铝不经胃肠道吸收，所以被广泛用于非处方药、混凝剂、食品添加剂及制作食具。近年来，铝的环境健康效应日益受到重视。有研究表明，某些神经系统疾病如早老性痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病等与铝的毒作用有关［1］。铝是一种肯定的神经毒物，它可通过饮水、食品添加剂、药品等途径进入人体并在神经系统内蓄积，造成神经系统慢性退行性改变［2］。以往认为胚胎和胎儿对铝的生物利用度很低，较少关注铝对胚胎和胎儿的神经发育毒性作用。随着抗酸剂用以缓解孕期“消化不良”症状的普遍使用，而抗酸剂中铝的含量较高，人们开始关注铝的神经发育毒性。AlCl3可经胎盘或乳汁转入胎鼠或乳鼠脑内［3］，虽然铝可以柠檬酸铝的形式从脑内排出，但有部分铝长期滞留，导致脑内蓄积［4］，柠檬酸铝、乳酸铝、三氯化铝经口染毒可引起大、小鼠不同程度母体和胎儿毒性［5］。张本忠［6］等报道，硫酸铝有一定胚胎毒性及致畸性，在大鼠体外全胚胎培养模型中，Al3+可显著抑制胚胎的生长发育和器官形态分化形成，导致胚胎发育畸形，主要表现为神经管缺陷、脑发育不良和体屈异常。铝的神经发育毒性已被研究者所共识，但极少见孕期染铝对胚胎脑神经元影响的报道。本实验采用NSE免疫组化染色及形态计量分析的方法来探讨母体孕期染铝对胚胎脑神经元的影响，为孕期染铝对子代神经系统的损伤提供更多形态学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物喂养及分组 选择60只4~5月龄健康清洁级SD大白鼠，体重(250±32.5)g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供（合格证号：SCXK（黔）20000001）。实验用试剂为氯化铝(广州化学试剂厂)，神经元特异烯醇酶抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。60只大鼠1:1合笼喂养，每天早晨查雌鼠阴栓，发现阴栓为E0，将孕鼠分为两组。染铝组15只，E0~El8期间用蒸馏水配制2％的氯化铝溶液按100 mg/（kg•d）灌胃；正常对照组15只，每天灌服等量蒸馏水。均用普通饲料喂养，自由饮用自来水。

1.2 取材与制片 取孕鼠18 d胚胎大脑，每只孕鼠任取其胚胎2只，每小组胎鼠30只。取胚胎时孕鼠用3.6％水合氯醛，按1 ml/100 g体重腹腔麻痹，开腹腔取胚胎全脑于4％多聚甲醛液中固定(固定前将颅骨剥开以利于固定液进入脑组织)。每只胎鼠脑冠切成三段，取中段经脱水、石蜡包埋后，进行连续冠状切片，片厚6um，隔3取1，进行NSE免疫组化染色。

1.3 免疫组化染色(SABC法)步骤如下 ①石蜡切片常规脱蜡至水；②蒸馏水新鲜配置3％H2O210 min，以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；③微波炉加热至沸腾后断电，间隔5~10 min后，重复1次，以修复抗原，冷却后0.02 mol/L磷酸盐缓冲液洗2次；④滴加5％正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余的液体，不洗；⑤滴加一抗(Rabbit AntiNSE，滴度：1∶200)，湿盒中孵育，4℃过夜，0.02 mol/L磷酸盐缓冲液洗2 min×3次；⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37℃孵育20 min，0.02 mol/L磷酸盐缓冲液洗2 min×3次；⑦滴加SABC，湿盒中37℃孵育20 min，0.02 mol/L磷酸盐缓冲液洗5 min×4次；⑧二氨基联苯胺显色，镜下控制显色深度，蒸馏水洗涤；⑨脱水、透明、封片。结果判定：以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞；对照组切片用磷酸盐缓冲液取代一抗，其余步骤同实验组。

1.4 图像分析 光镜下采用Mias图像分析软件，每个胎鼠脑取相同间隔的3张切片，对每张切片的相应部位各测3个视野，同一放大倍数，同一视场面积，同一背景光强度下，计数大脑皮质Par1区内椎体细胞层NSE免疫组化染色阳性细胞，测定NSE阳性反应产物的平均光密度值。

1.5 统计学方法 用SPSS12.0统计软件行统计处理，数据采用(x±s)表示，两样本对应参数平均值方差齐性用F检验，均值间比较用t检验；检验水准a=0.05。

2 结果

光镜下，正常对照组胎鼠大脑皮质Par1区内椎体细胞层NSE免疫组化染色阳性神经元较多，细胞呈圆形或椎体形，胞体发出突起伸向皮质表面，胞核位于中央，不着色，胞浆及突起内有丰富的棕黄色阳性反应产物，染色深，胞核大位于中央，不着色（图A）。染铝组胎鼠Par1区内椎体细胞层NSE阳性细胞较正常对照组胎鼠阳性细胞少，胞浆内棕黄色反应颗粒染色稍淡，胞体发出突起伸向皮质表面，胞核大位于中央，不着色（图B）。染铝组18 d胚胎脑皮质Par1区内椎体细胞层NSE阳性细胞数分别较对照组胚胎减少（P

3 讨论

神经元是神经系统的结构和功能单位，研究发现，许多神经系统疾病的发生都是由于神经元数量、形态或功能的异常所致。Al3+具有多种生物学效应导致神经元死亡,引起神经系统疾病。如铝与早老性痴呆、透析性脑病综合征密切相关［6］。铝可诱导大鼠脑神经元凋亡［7］，铝可对原代培养皮层神经细胞产生细胞毒性，抑制皮层神经细胞生长［8］。本实验研究发现孕鼠染铝，其胎鼠大脑皮质神经元与相应对照组胎鼠比较数量减少。综合文献资料，孕鼠染铝导致胎鼠大脑皮质神经元减少的原因如下：①孕期染铝，铝在胎鼠脑内蓄积，铝对神经元的毒性作用致使神经元数量减少；孕期染铝，铝在胎鼠脑内蓄积，铝可通过改变神经元的钙稳定，或与神经细胞的DNA结合［9］，以及铝蓄积产生活性氧等影响神经元结构和功能。另据Virgilia［10］等报道，铝致脑组织ATP酶活性降低，细胞膜完整性被破坏，可能也是铝的神经毒性机制之一;②孕鼠染铝，铝在胎鼠脑内蓄积，铝抑制胎鼠脑神经干细胞向神经元分化致使神经元数量减少；神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，因此神经干细胞在神经系统发育过程中具有特别重要的作用。神经干细胞的分裂增殖受很多因素影响，包括基因方面、细胞因子、细胞外基质、细胞黏附分子等［11］。胡琼［12］等报道铝可抑制大脑皮层神经干细胞向神经元分化;③孕鼠染铝致胎鼠脑神经干细胞减少,使其分化的神经元数量减少。本人在前期研究中发现孕鼠染铝可导致仔鼠海马齿状回神经干细胞数量减少［13］，神经干细胞具有分化为神经元的能力，由于神经干细胞数量减少可能导致其分化的神经元数量减少。以上原因均可导致孕期染铝胎鼠脑神经元的减少，从而引起子代神经行为和智力发育的异常。

参 考 文 献

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［3］ Yumoto S,Nagai H,Matsuzaki H,et al.Aluminium incorporation into the brain of rat fetuses and sucklings.Brain Research Bull,2001,55(2):229234.

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［5］ 陈丽,张本忠.氟铝联合对大鼠胚胎发育毒性的体外实验研究.中国地方病学杂志,2007,26(2): 133136.

［6］ 梁峰.铝与人类疾病研究现状.微量元素与健康研究,2006,23(1):6466.

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［8］ 李百祥,任锐,杨德文.氯化铝对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞的毒性作用.中华劳动卫生职业病杂志,2006,24 (3): 179182.

［9］ 胡琼,王取南.铝对神经系统的毒性作用研究进展.国外医学卫生学分册,2005,32(2):113116.

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［12］ 胡琼,王取南,李嘉嘉.铝对大鼠神经干细胞向神经元分化的影响.安徽医科大学学报,2005,40 (3):210213.

［13］ 蒋鸫,康朝胜,余资江.孕鼠铝暴露对仔鼠齿状回经干细胞的影响.解剖学杂志,2009,32(5):657659.