高剂量60Co―γ射线辐照对紫花苜蓿种子的诱变及致死效应伏

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摘要：利用高剂量60co-γ射线辐照处理紫花苜蓿（Medicago sativa L.）干种子，比较研究不同辐照剂量（1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy）对种子发芽率、幼苗长度、形态的影响。结果表明，高剂量γ射线辐照可以抑制紫花苜蓿种子的萌发，随着辐照剂量的增加，种子发芽率显著降低，当辐照剂量达到11.90 kGy时，种子发芽率为0，导致种子失活。随着辐照剂量的增加，发芽幼苗长度显著降低，1.45 kGy照射种子，萌发96 h后，其长度仅为对照的55.00%，7.96 kGy处理种子的长度只有对照的22.78%。说明高剂量辐照对种子的诱变致畸效果显著增加。

关键词：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；60Co-γ射线；发芽；种子；诱变育种

中图分类号： S542 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3708-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.15.033

Abstract： Seeds of Medicago sativa L. were irradiated by 1.45，3.75，5.98，7.96，11.90 kGy 60Co-γ rays， the germination percentage，seedling length were studied in different dose treatment. The results showed that high dose irradiation inhibited seed germination，with the dose increased，the germination percentage significantly decreased，the seeds dead by 11.9 kGy 60Co-γ rays irradiation.With the increase of radiation dose，seedling length significantly reduced， after 96 h incubated，the 1.45 kGy dose treated seedling length just 55.00% of control，7.96 kGy dose treated seedling length just 22.78% of control，indicated that high dose irradiation on Medicago seed caused the mutation effects increasing significantly.

Key words： Medicago sativa L.；60Co-γ rays；germination；seed；mutation breeding

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）属豆科蝶形花亚科苜蓿属一年生或多年生宿根性草本植物[1]。紫花苜蓿素有“牧草之王”的称号，是世界上最重要、最有价值的栽培牧草，在全世界范围内广泛种植。美国是世界上紫花苜蓿种植面积最大的国家，种植总面积超过了1 000万hm2，约占世界总种植面积的33%；中国居第五位，约占世界种植总面积的4.5%，分布于全国14个省区[1，2]。紫花苜蓿的适应性强，产量高，且品质好，营养价值高，含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素等重要的营养成分，而且还含有氨基酸、微量元素及未知生长因子，可作为很好的精饲料替代品。紫花苜蓿适口性好，家畜都比较喜食，易消化。紫花苜蓿对土壤要求不高，喜中性或微碱性土壤（pH8），但不耐强酸或强碱性土壤；紫花苜蓿的根系发达，能吸收到土壤深层的水分和养分，还可减少地表径流，起到保持水土的作用[3，4]。

中国的苜蓿产业化起步比较晚，但近年来发展比较快。随着中国的西部大开发和退耕还林还草工作的深入，农牧产业结构调整，畜牧业得到迅猛发展，紫花苜蓿的种植范围随之不断扩大。紫花苜蓿的种植已不仅仅局限于北方地区，近年来南方也进行了引种，并且也有新品种培育成功，在南方地区得到了初步试验推广。但是，想要紫花苜蓿产业在南方地区得到长足的发展，在这样的形势之下，亟待解决的就是紫花苜蓿与南方环境的矛盾问题。解决这一矛盾的根本办法就是选育出适宜本地地理环境和气候条件的优良品种，人工诱变法获得优良品种的种质资源是较快捷的方法之一。

60Co-γ射线辐照是最为有效的人工诱变育种方法之一，已经在农作物育种中得到广泛应用[5]。利用60Co-γ射线辐照人工诱变育种紫花苜蓿的研究相对较少，本研究探讨不同60Co-γ射线辐照剂量对紫花苜蓿种子发芽率、生长情况、根尖细胞活性氧代谢的影响，为紫花苜蓿的人工诱变育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以紫花苜蓿（威纳尔）为供试材料。

1.2 试验处理

利用四川省原子能研究院60Co-γ射线辐射源对紫花苜蓿种子进行辐照处理，共设置1个对照组和5个照射处理组，各组的设计照射剂量为1、3、5、8、10 kGy，照射过程通过吸收剂量监测，实际测得各组的吸收剂量分别为1.45、3.75、5.98、7.96、11.90 kGy。

经过照射后的种子用蒸馏水冲洗，除去杂质和干瘪的种子，再用蒸馏水清洗3遍，备用。将两层定性滤纸平铺于直径为9 cm的培养皿中，加入5 mL的蒸馏水作为发芽床，放置紫花苜蓿种子，每个培养皿中放入35粒种子，每个处理设置3个平行。开始培养时间记作第0小时，于第48小时再加入5 mL蒸馏水。所有种子均在光照培养箱中培养，前60 h完全避光培养，从第61小时开始光照（光照∶黑暗12 h∶12 h）进行培养，培养温度为28 ℃。每隔24 h观察记录种子的发芽率，第96小时对已发芽种子进行收集，测定其长度，观察根尖形态特征。

1.3 根尖NBT染色

NBT （P-nitroblue tetrazolium）能够和超氧阴离子（O2・-）反应形成甲瓒呈蓝紫色，根部产生的O2・-与NBT反应后形成的颜色深浅能反映O2・-产生的多少。分别取各处理萌发种子10株，按照Dunand等[6]的方法进行NBT染色，然后用体视显微镜观察根尖形态特征并拍照。

1.4 数据处理

数据用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 不同辐照剂量对紫花苜蓿种子发芽率的影响

经过γ射线辐照处理后，紫花苜蓿种子的发芽率总体上呈现下降的趋势（图1，图2）。种子经培养24 h后，经过辐照处理的紫花苜蓿种子发芽率均显著低于对照，且辐照剂量大于5.98 kGy照射的种子基本上没有发芽（图1）。培养48 h后，1.45 kGy和3.75 kGy辐照种子的发芽率略高于对照，但是差异不显著（P0.05），5.98 kGy和7.96 kGy照射种子的发芽率分别达到55.24%和33.33%，极显著低于对照水平（P0.01）；发芽72 h和96 h后1.45 kGy辐照种子的发芽率略高于对照，但是差异不显著（P>0.05），3.75 kGy辐照种子的发芽率与对照持平，辐照剂量大于5.98 kGy照射的种子发芽率低于对照水平，但是差异在逐渐缩小（图1）。整个试验过程中，辐照剂量为11.90 kGy的紫花苜蓿种子始终未发芽（图2）。

2.2 不同辐照剂量对紫花苜蓿种子发芽幼苗长度的影响

由图3可知，经过96 h发芽后，各剂量辐照处理的紫花苜蓿发芽种子长度随着辐照剂量的增加逐渐降低，降低的幅度与对照相比差异极显著（P0.01）。1.45 kGy处理种子的长度已经显著降低，为对照的55%。7.96 kGy处理种子的长度只有对照的22.78%。11.90 kGy辐照的种子没有发芽，因此其长度记为0，图中未显示，说明11.90 kGy剂量照射紫花苜蓿种子已经导致种子失活，该剂量为紫花苜蓿种子的致死剂量。

2.3 不同辐照剂量对紫花苜蓿种子发芽幼苗形态的影响

由图4可知，经过辐照处理的种子发芽后，幼苗的长度显著低于对照的水平，图3中统计结果一致。辐照后的幼苗根芽长都显著降低，其根部变得短粗，根部生长不规则程度增加。经过辐照后的种子幼苗根分生区显著变短，说明该部位细胞生长受到严重的抑制，导致植株长度变短。7.96 kGy辐照的种子萌发后，子叶明显变黄，并且部分子叶上出现了黄色条纹，说明高剂量的辐照处理，对其损伤比较严重。

活性氧是细胞代谢的次生副产物，包括超氧阴离子（O2・-）、羟自由基（OH・）、过氧化氢（H2O2）等，近年来的研究证明，活性氧参与调控根尖细胞的生长[7，8]。为了进一步验证，辐照对萌发种子的损伤，对其根尖超氧阴离子（O2・-）的产生进行NBT原位染色观察。由图5可知，对照根尖分生区细胞活性氧产生较多，分生区较长，而经过不同剂量辐照的种子，萌发后的根尖分生区明显比对照短，随着辐照剂量的增加，根尖分生区长度呈现递减的趋势，尤其是经过7.96 kGy辐照的种子，萌发后的根尖分生区基本上观察不到与对照一样紫得发黑的区域，说明细胞生长严重受阻。另外，从图中还可看到，对照组根部表面光滑，形态均匀，而辐照处理各组的根部表面凹凸不平，形态不规则，随着辐照剂量的增加不规则程度也越发严重。

3 讨论

3.1 高剂量辐照对紫花苜蓿种子的诱变及致死效应

不同植物甚至同种植物的不同品种间对60Co-γ射线辐照的敏感性都有较大的差别[9，10]，经过前期的试验发现，低剂量照射对紫花苜蓿（威纳尔）种子萌发的影响不明显，因此采用高剂量60Co-γ射线辐照紫花苜蓿种子，观察不同60Co-γ射线辐照剂量对紫花苜蓿种子萌发的影响。试验结果证明，高剂量辐照能够引起紫花苜蓿种子发芽率降低，生长长度降低，说明高剂量辐照使紫花苜蓿种子的生物活性降低。其中，经11.90 kGy辐照处理的种子，全部没有发芽，说明该剂量照射导致种子全部失活，种子死亡，11.90 kGy是紫花苜蓿种子的致死剂量。紫花苜蓿种子的发芽率在24 h时随着辐照剂量的增加而降低，且经5.98、7.96 kGy辐照的种子均未发芽（图1），但随着发芽时间的增加，各处理组发芽率逐渐增加，并且与对照组的差距逐渐缩小，而且1.45 kGy辐照种子的发芽率在萌发48 h后均高于对照，说明高剂量辐照种子的萌发具有滞后性。

近年来的研究表明，活性氧在植物生长发育过程中扮演着重要的角色，Muller等[11]证明活性氧能攻击细胞壁的多糖，引起细胞壁松动，进而调节植物种子萌发和幼苗生长。NBT染色结果表明，经过辐照种子萌发后，根尖分生区明显比对照组短，说明受辐照的影响，超氧阴离子产生受到影响，使根尖分生区细胞生长受到显著抑制。另外，张月学等[12]对高剂量60Co-γ射线辐照紫花苜蓿种子幼苗的根尖细胞进行观察发现，γ射线辐照苜蓿种子可以抑制根尖细胞有丝分裂，并诱发根尖细胞产生单微核、双微核、多微核、小核、染色体断片、染色体黏连、单桥、双桥、多桥、游离染色体、落后染色体等多种畸变。在0～2 000 Gy范围内，随剂量的增加各种畸变率不断提高，至2 000 Gy辐照剂量时，各种畸变率达到最高。由于γ射线辐照导致紫花苜蓿根尖细胞染色体的变异是抑制种子幼苗生长的原因之一，染色体不能够进行正常的复制，导致有丝分裂减缓，根尖分生区生长受抑制。

3.2 60Co-γ射线辐照在紫花苜蓿育种中的潜力

采用辐射诱变培育作物新品种，能够提高植物的变异频率，扩大变异范围，缩短育种时间，获得某些优良性状。利用60Co-γ射线辐照育种已经取得了一些很好的农作物品种。中国在20世纪60年代开始对果树进行辐照诱变育种，1963年中国农业科学院柑橘研究所用γ射线照射锦橙的干种子，育成产量高、品质好、少核的418红橘、中育7号、中育8号[13]。李建黎等[14]利用60Co-γ射线辐照育种，筛选出了综合性状较好的大豆新品系。近年来利用60Co-γ射线辐照育种的作物品种不断扩大，赵兴华等[15]以60Co-γ射线辐照处理切花百合“科瓦拉”、“不同凡响”、“双重惊喜”的鳞茎，开展辐射诱变育种试验。曾捷等[16]以牧草型‘雅安’扁穗牛鞭草（Hemarthria compressa “Ya’an”）和草坪型“H055”扁穗牛鞭草（pressa “H055”）为材料，研究了60Co-γ射线诱变的适宜照射剂量。

本研究利用高剂量（1～10 kGy）的60Co-γ射线辐照紫花苜蓿的干种子，通过种子萌况，观察高剂量辐照对紫花苜蓿种子萌发的影响。结果显示，随着辐照剂量的增加，其发芽率逐渐降低，幼苗长度逐渐降低，说明种子受损伤程度逐渐增加。在辐照育种中，选择适宜的辐照剂量对于育种来说至关重要，目前一般选择种子的半致死剂量进行辐照，但是对于半致死剂量的计算方法还没有统一的标准[17]，从本试验结果来看，在1.45 kGy辐照剂量条件下，萌发96 h种子的长度约为对照的一半，种子萌发24 h后其发芽率约为对照的一半，且根据包建忠[10]等的试验结果来看，1 000 Gy辐照种子萌发后，根尖细胞的畸变率已经高于14%，这为紫花苜蓿60Co-γ射线诱变育种提供了参考。

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