复方白毛夏枯草免疫调节作用的实验研究
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作者：王文佳，李海峰，欧江琴，田维毅
【摘要】 目的探讨复方白毛夏枯草对实验小鼠免疫功能的影响。方法实验小鼠随机分为复方白毛夏枯草大、中、小剂量组和生理盐水对照组，给予相应的药物及生理盐水灌胃7 d后，测定胸腺指数、脾脏指数、ea花环形成率、吞噬细胞吞噬中性红的能力、脾淋巴细胞转化能力、血清igg及igm含量。结果与生理盐水对照组比较，复方白毛夏枯草各组小鼠的胸腺及脾脏指数无明显差异（p＞0.05）；腹腔巨噬细胞的数量明显增加（p＜0.05），同时吞噬能力也明显增强（p＜0.05或p＜0.001），以中、大剂量用药组最显著；血清中免疫球蛋白igg的含量明显升高（p＜0.05或p＜0.01），大剂量用药组含量最高，而血清中免疫球蛋白igm的含量无明显变化（p＞0.05）；脾脏淋巴细胞增殖能力有显著提高（p＜0.01或p＜0.05或p＜0.001），以大剂量用药组增殖最显著。结论复方白毛夏枯草对实验小鼠免疫功能总体上表现为增强效应。
【关键词】 复方白毛夏枯草； 小鼠； 免疫调节
复方白毛夏枯草由苗药白毛夏枯草、麦冬等组成，具有清热解毒、止咳化痰、消肿润肺之功，是贵州省少数民族用于治疗上呼吸道感染的经验方，对上呼吸道感染引起的发热、咽痛、久咳不止等症效果尤为明显。为探索该方的临床疗效机制，笔者对其免疫调节功能进行初步研究，为其临床应用提供药理学依据。
1 材料与仪器
1.1 动物及分组
健康昆明种小鼠120只,体质量(20±2)g,雌雄不分,贵阳医学院实验动物中心提供,合格号为scxk（黔）2002-0001。随机将小鼠分为4组，即复方白毛夏枯草大剂量组、中剂量组、小剂量和生理盐水对照组，每组30只，雌雄分笼饲养。
1.2 仪器与试剂
usa3131型co2培养箱（美国热电），eix808u型全自动酶标仪（美国biotek）、bsc1800-ⅱ-a/b3型生物安全柜（上海瑞仰），小鼠igg、igm酶联免疫试剂盒（批号分别为080418、080110,上海门谍塔生物科技发展有限公司）；四甲基偶氮唑盐(mtt)（ phamacia 公司），植物血凝素（pha）（sigma 公司），rpmi-1640营养液（serva 公司），中性红(amresco 公司) ,兔抗羊红细胞抗体（a）（河南知微生物工程有限公司），10%绵羊红细胞悬液（e）、3%硫乙醇酸钠溶液，hank，s液，以上试剂均按常规方法配置。
2 方法
2.1 药物及给药方法
将复方白毛夏枯草各药材依验方比例配伍，常规制备水煎剂，按成人临床用药量换成小鼠用药量，调整浓度为大、中、小3个剂量（分别相当于生药1，0.5，0.25 g/ml）备用。各给药组小鼠每次分别按10，5，2.5 g/kg灌服复方白毛夏枯草水煎剂，对照组代以等量生理盐水，2次/ d，连续灌胃7 d。所有动物按常规饲养。
2.2 免疫指标检测
2.2.1 胸腺指数、脾脏指数检测
给药结束次日，各组随机取小鼠10只，摘眼球无菌取血并分离血清备用；同时，脊椎脱臼处死小鼠后，取胸腺、脾脏称湿重并计算胸腺和脾脏指数［胸腺或脾脏质量(g)与每100 g体质量的比值］。
2.2.2 ea花环法测定巨噬细胞fc受体
实验按照文献方法进行［1］。在显微镜下，以周围粘附5个或5个以上ea的巨噬细胞为ea花环阳性,随机计数200个巨噬细胞，算出ea花环阳性百分率。
2.2.3 elisa测定血清igg、igm 含量
使用上述血清0.1 ml,按照elisa 试剂盒操作说明测定小鼠血清中igg、igm量。
2.2.4 中性红比色法检测吞噬细胞吞噬能力
按文献方法［2］。在末次给药后，各组随机取小鼠10只，腹腔注射3%硫代乙醇酸钠0.02 ml/g体质量，6 h后无菌取腹腔液，常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,并调整浓度至1×106/ml，加至96孔板中，100 μl/孔，置37℃、5%co2培养箱贴壁孵育2 h，弃去上清，加0.072%中性红溶液100 μl/孔，继续孵育30 min，弃去上清，以hank's液洗3次，加入dmso 100 μl/孔，置4℃冰箱过夜，置酶标仪490 nm处测定各孔od值。
2.2.5 mtt比色法测定脾脏淋巴细胞增殖能力
参考文献方法［3］。各组剩余小鼠末次给药后2 h, 无菌取脾细胞，常规制备小鼠脾细胞悬液,并调整浓度至2×106/ml，加至96 孔培养板中l00 μl/孔,再加入含3%pha完全rpmi-1640培养液100 μl/孔,另设对照组加入不含pha的完全rpmi-1640 培养液100μl/孔，每个样品设3个复孔，置37℃、5%co2培养箱中贴壁培养72h，吸上清液50μl弃之,加入5 mg/ml的mtt10 μl/孔, 置co2 培养箱孵育6 h 后,加入dmso 100 μl/孔，充分振荡后, 静止10 min, 置酶标仪570 nm处测定各孔od值, 淋巴细胞增殖能力用pha+与pha-的od均值差表示。
2.3 统计学处理
各组均数用±s表示，组间差异用spss 11.5软件进行单因素方差分析。
3 结果
3.1 胸腺指数、脾脏指数
与生理盐水对照组比较，复方白毛夏枯草各组小鼠胸腺指数和脾指数均无明显差异（p＞0.05）。见表1。表1 复方白毛夏枯草对小鼠免疫器官的影响（略）
3.2 巨噬细胞fc受体
与生理盐水对照组相比，复方白毛夏枯草小剂量组小鼠巨噬细胞fc受体的ea花环形成率无明显差异(p＞0.05)，中、大剂量组ea花环形成率有明显差异( p＜0.05)；复方白毛夏枯草各剂量组间ea花环形成率无明显差异(p＞0.05)。见表2。表2 复方白毛夏枯草对小鼠巨噬细胞fc受体的影响（略）
3.3 血清igg、igm 含量
与生理盐水对照组比较，复方白毛夏枯草小、中剂量组小鼠血清中igg含量有明显差异( p＜0.05) ，大剂量有非常明显差异( p＜0.01)；复方白毛夏枯草各剂量组间血清igg含量无明显差异(p＞0.05)；复方白毛夏枯草各剂量组血清igm含量与生理盐水组无明显差异(p＞0.05)。见表3。表3 复方白毛夏枯草对小鼠血清中igg和igm含量的影响 （略）
3.4 吞噬细胞
与生盐水对照组比较，复方白毛夏枯草小剂量组小鼠巨噬细胞吞噬能力有明显差异( p＜0.05) ，中、大剂量有非常显著差异( p＜0.001); 与中药小剂量组比较，中、大剂量组小鼠巨噬细胞吞噬能力有非常显著差异( p＜0.001)，但中剂量组与大剂量组间无明显差异（p＞0. 05）。见表4。表4 复方白毛夏枯草对小鼠巨噬细胞吞噬中性红功能的影响（略）
3.5 pha刺激的脾细胞增殖能力
与生理盐水对照组比较，复方白毛夏枯草小剂量组有显著差异( p ＜0.01)，中剂量有明显差异( p ＜0.05)，大剂量组有非常显著差异( p ＜0.001)；各剂量组间无明显差异（p＞0.05）。见表5。
4 讨论
上呼吸道感染为临床常见病、多发病，若经久不愈，可发展为肺炎、哮喘等严重疾病［4］。本病多因机体抵抗力下降，病毒、细菌等病原体趁机感染机体，出现鼻塞、流涕、发热、咳嗽、吐痰、咽痛等鼻腔、咽或喉部急性炎症，属中医“外感”范畴，治疗以“扶正祛邪”为根本大法。
复方白毛夏枯草由苗药白毛夏枯草、麦冬等组成，是贵州苗族用于治疗上呼吸道感染的验方，具有清热解毒、止咳化痰、消肿润肺之功，对上呼吸道感染引起的发热、咽喉肿痛、久咳等症疗效显著。为探讨该方疗效机制，在前期抗菌作用研究的基础上，笔者对其免疫调节作用进行初步实验研究。结果显示，与生理盐水对照组相比，复方白毛夏枯草中、大剂量组小鼠腹腔巨噬细胞ea花环形成率明显增加（p＜0.05)，同时，复方白毛夏枯草各剂量组小鼠吞噬细胞吞噬能力都有明显升高（p＜0.05或p＜0.001)，提示该方可提升实验小鼠巨噬细胞数量和吞噬活性。与对照组比较，复方白毛夏枯草各剂量组小鼠血清中igg含量明显升高（p＜0.05或p＜0.01)，而igm含量无明显差异（p＞0.05），提示该方主要对igg介导的特异性体液免疫功能具有促进作用。实验结果显示，复方白毛夏枯草各剂量组能明显促进pha刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖能力（p＜0.01或p＜0.05或p＜0.001)，但各组小鼠胸腺指数和脾脏指数与对照相比无明显差异（见表1）,这提示，该方对淋巴细胞免疫功能的促进作用主要是针对免疫原活化后的淋巴细胞。表5 复方白毛夏枯草对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响（略）
免疫功能是机体防御和清除各种有害因素的重要作用，是体内“正气”的主要体现，包括非特异性免疫功能和特异性免疫功能。本文通过初步观察复方白毛夏枯草对实验小鼠巨噬细胞吞噬能力等非特异性免疫指标和血清igg/igm 含量、脾淋巴细胞转化能力等特异性免疫指标，以期探索该方的免疫调节效应。结果显示，该方对实验小鼠上述部分免疫功能具有不同程度的促进作用，其中对巨噬细胞吞噬中性红能力的促进作用呈现剂量相关性，提示该方治疗上呼吸道感染的作用与其调节机体免疫功能有关。
【参考文献】
1］关晓辉，曲娴，杨志萍，等.白术挥发油对小鼠免疫功能的影响［j］.北华大学学报，2001，2(2):122.
［2］张晓莉, 唐小云, 宋宝辉，等.六君子汤上调小鼠免疫功能的机制［j］.细胞与分子免疫学杂志，2005, 21(6):784.
［3］薛彬.免疫毒理学实验技术［m］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：142.
［4］叶任高.内科学，第5版［m］.北京：人民卫生出版社，2001：11.