反相高效液相色谱法测定巴洛沙星有关物质的方法学研究
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【摘要】 目的 采用RP-HPLC法测定巴洛沙星的有关物质。方法 使用SMT C18柱(250mm×4.6mm，5μm)， 流动相为乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液(47：53)［用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0］，检测波长为295nm，流速为1.0ml/min。结果 巴洛沙星与各有关物质在上述色谱条件下能有效地分离。结论 该方法结果准确、操作简单、灵敏度高、专属性强，适用于巴洛沙星的有关物质测定。
Study on determination of related substances in balofloxacin by RP- HPLC
【Abstract】 Objective The reversed phase high performance liquid chromatography method was established to determine the related substances in balofloxacin.Methods The column is SMT C18(250mm×4.6mm×5μm).The mobile phase is compound solution of acetonitrile and 0.4% lauryl sodium sulfate(47：53)［adjusted pH to 3.0 by citric acid(1.5mol/L)］， the detection wave length is 295nm， the flow rate is 1.0ml/min. Balofloxacian and all of the related substances can be separated efficiently with this determineation of the related substances in balofloxacin. The column is SMT C18(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase is compound solution of acetonitrile and 0.4% lauryl sodium sulfate(47：53) ［adjusted pH to 3.0 by citric acid(1.5mol/L)］， the detection wave length is 295nm， the flow rate is 1.0ml/min. Results Balofloxacian and all of the related substances can be separated efficiently with this condition. The method is accurate， simple ，rapid and exclusive.Conclusion It could be used for determination of related substances in balofloxacin.
【Key words】 balofloxacin；reversed phase high performance liquid chromatography
巴洛沙星(balofloxacin)系由日本中外制药株式会社与韩国Choongwae公司共同开发的氟喹诺酮类抗菌药，于2002年首次在韩国上市［1～2］。对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌具有广谱抗菌活性，对细菌具有选择性抑制作用，体外抗菌活性是环丙沙星、氧氟沙星和洛美沙星的4～16倍［3］；与托氟沙星和司帕沙星类似［4］。由于巴洛沙星在其母核的8位引入了一甲氧基，使其不仅增加了对革兰阳性菌的抗菌活性，而且避免或减少光过敏或光毒性及细胞毒性［5］。巴洛沙星是以羧酸乙酯为起始原料，先和三乙酸硼反应生成螯合物Ⅰ，再和3-甲胺基哌啶二盐酸盐缩合反应得螯合物Ⅱ，然后水解制得。该路线是目前制备巴洛沙星的最优路线［6］。测定巴洛沙星的有关物质常用液相色谱法，俞红等［7］报道，用流动相为0.05mol/L柠檬酸-乙腈（60：40）［三乙胺调pH=4］的反相液相色谱法测定主要中间体羧酸乙酯在巴洛沙星中的含量。本实验通过摸索新的色谱条件，采用乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液为流动相的高效液相色谱法，能同时测定了巴洛沙星的合成中间体羧酸乙酯、螯合物Ⅰ及螯合物Ⅱ。该方法简单准确、分离效果好，对巴洛沙星的质量控制具有明显的实用价值。巴洛沙星及各中间体的结构式如图1所示。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪—Waters 515泵；2487紫外检测器。巴洛沙星样品自制，样品批号：20041015、20041020、20041024；对照品自制，含量：99.7%；羧酸乙酯（江阴市永达化工有限公司），螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ均自制；乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 实验溶液的制备 供试品溶液：取巴洛沙星（批号：20041024）约10.2mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；中间体溶液：取羧酸乙酯14.0mg、螯合物Ⅰ11.3mg、螯合物Ⅱ10.3mg，分别置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；混合溶液：取供试品溶液及各中间体溶液各1份，混合，即得。
图1 巴洛沙星及中间体的结构式
Fig. 1 Structural formula of balofloxacin and intermediates
1-巴洛沙星；2-羧酸乙酯；3-螯合物Ⅰ；4-螯合物Ⅱ1.3 色谱条件 色谱柱：SMT C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液(47：53)［用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0］；检测波长：295nm；流速：1.0ml/min；柱温：室温；进样量：20μl。
2 结果与讨论
2.1 测定波长的选择 分别称取巴洛沙星及各中间体适量，分别加乙腈溶解制成每1ml中约含6μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录ⅣA)，在200～400nm的波长处扫描，结果显示巴洛沙星在295nm处吸收最强，且其他中间体在295nm附近有较大的吸收，故选择295nm为本品有关物质测定的检测波长。
2.2 色谱柱及流动相的选择 色谱柱：(1)DiamonsilTM C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；(2)Kromasil C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；(3)SMT C18柱（5μm， 4.6mm×250mm）。流动相：(1)参照中国药典2000年版二部沙星类药物有关物质测定，采用流动相：乙腈-0.05mol/L枸橼酸溶液(20： 80)［用三乙胺调pH值至3.5］；(2)乙腈—0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）［用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0］。
采用上述不同的色谱柱和流动相进行实验，结果表明：采用色谱柱(1)或(2)及流动相(1)，虽然主峰出峰时间适中且峰形较好，但各中间体在此流动相中50min都未见出峰；采用色谱柱(1)或(2)及流动相(2)，样品及各中间体出峰时间适中，但峰拖尾严重；采用色谱柱(3)及流动相(2)，样品及各中间体出峰时间适中，且峰形较好。所以选择采用色谱柱(3)及流动相(2)来检测本品的有关物质。
2.3 系统适用性试验 取1.2项溶液各20μl分别注入液相色谱仪进行测定，并记录色谱图，测定结果见表1及图2。试验结果表明：巴洛沙星与各中间体在上述色谱条件下能有效地分离。
表1 巴洛沙星与中间体液相色谱保留时间
Tab.1 Chromatograms retention time of balofloxacin and related substances
图2 巴洛沙星有关物质系统适用性试验HPLC图
Fig. 2 Chromatograms obtained from the system applicability test of related substances in balofloxacin
1-螯合物Ⅰ；2-羧酸乙酯；3-螯合物Ⅱ；4-巴洛沙星
2.4 专属性试验 取供试品溶液9ml，加1.0mol/L盐酸溶液1ml，置水浴(60℃)中放置12h，加1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为酸破坏溶液；取供试品溶液9ml，加1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，置水浴(60℃)中放置12h，加1.0mol/L盐酸溶液调节溶液的pH值至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为碱破坏溶液；取供试品溶液9ml，加30%过氧化氢1ml，置水浴(60℃)中放置12h，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为氧化破坏溶液。经强酸、强碱、强氧化破坏试验，结果表明：在此色谱条件下，各降解产物峰与主峰均能达到基线分离。
2.5 最低检出量 取巴洛沙星对照品及各中间体适量，分别用流动相逐级稀释后进样，当信噪比为3：1时，测得巴洛沙星、羧酸乙酯、螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ的最低检出量分别为1.12×10-2ng、0.272ng、2.016ng、0.208ng。
2.6 溶液的稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h测定，测得溶液在12h内的平均峰面积为99497023.7，RSD为0.35%，说明本品溶液基本稳定。结果见表2。
表2 样品溶液稳定性试验结果
Tab.2 Test result of determine sample solution stability
2.7 有关物质的测定 各取3批巴洛沙星供试品适量，分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中含巴洛沙星约为0.1mg的溶液，按1.3色谱条件检查有关物质，结果见表3及图3。实验结果表明：3批供试品有关物质结果均小于1.0%。
表3 3批供试品有关物质检查结果
Tab.3 Test result of determine related substances in three sample
图3 巴洛沙星有关物质测定HPLC图
Fig. 3 Chromatograms of determine related substances in balofloxacin
1、2-杂质峰；3-巴洛沙星
【参考文献】
1 Alksne L. Balofloxacin Choongwae.Curr Opin Investig Drugs， 2003，4：224-229.
2 廖斌，丛欣，廖清江. 2002年世界上市的新药. 药学进展，2003，27（3）：190-193.
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6 刘明亮，刘秉全，孙兰英，等. 巴洛沙星的合成.中国医药工业杂志，2004，35(7)：385-388.
7 俞红，戴真南，缪玉山，等. 用RP-HPLC法测定巴洛沙星中间体含量的方法学研究.现代医学，2004，32（2）：85-87.