光合细菌中氢化酶的分离纯化及其性质研究
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摘要:以光合细菌为出发菌株，离心得到的菌体经超声破碎后，得到的粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-52 离子交换层析和Sephadex G-200分子筛凝胶层析分离纯化获得电泳纯的氢化酶,且该酶的分子量为 62.0 ku和37.0 ku的两个亚基组成的分子量为99.0ku的二聚体,对该酶进行酶学性质的研究得到酶催化最适温度和pH值范围分别为30-℃和pH =7.5,且在25~35-℃和pH =7.0～8.0范围内催化放氢活力较稳定.
中图分类号:O629.8 文献标识码:A文章编号:1672-8513(2010)01-0046-03
Purification and Characterization of the Hydrogenase
Extracted from Photosynthetic Bacteria
LIANG Zhihua WANG Mengliang
(Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)
Abstract:
The purification and characteristics of an enzyme extracted from Photosynthetic Bacteria were studied. First, cells were disrupted by ultrasonic treatment. The hydrogenase was purified with a combination of ammonium precipitation, dialysis, DEAE-52 anion exchange chromatography and Sephadex G-200 gel filtration chromatography. The native molecular mass of the enzyme was found out to be the dimer of 99.0ku. The optimum pH and temperature for hydrogen production activity of the hydrogenase is 7.5 and 30 ℃.
Key words:
photosynthetic bacteria; hydrogenase; purification
氢化酶是一类存在于微生物体内的重要生物酶,不仅能催化H2的氧化和质子的还原反应，而且在微生物的能量代谢中也起着重要的作用［1-2］.氢化酶潜在的应用价值被应用于实践生产的各个方面,例如氢的生产、生物治理、生物燃料和生物传感器等［3-4］.
1 材料与方法
1.1 菌种、试剂和仪器
菌种为本实验室保藏菌种类球红杆菌(Rhodobacter Sphaeroides).
DEAE-52 离子交换树脂、Sephadex G-200分子筛凝胶、柱层析系统(安玛西亚中国有限公司);聚乙二醇（PEG，20 000）;苯甲基磺酰氟(PMSF,Amresco);高速冷冻离心机(日立CR22G);冷冻真空干燥仪(美国Savant公司);超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司制造);紫外-可见分光光度计(日本岛津公司制造);电泳仪(Thermo EC120); 其它试剂购自上海化学试剂公司,均为市售分析纯或化学纯.
1.2 分离菌无细胞提取物的制备
将离心收集的菌体10-g，以1/3(g/mL)的比例，用10-mmol/L Tris-HCl(pH =7.5)缓冲液稀释成菌悬液，超声破碎10-min(工作2-s间歇3-s)，保持菌液始终处于低温0~4-℃.破碎后在-8-000-r/min下冷冻离心10-min，所得上清液为粗酶液.
1.3 氢化酶的分离纯化
饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的硫酸铵进行分段盐析沉淀酶液，离心收集沉淀物，用Tris-HCl 缓冲液复溶.取盐析沉淀的粗酶液经透析浓缩后上DEAE-52 离子交换柱，进行洗脱，收集活性部分.将收集的活性部分透析后超滤浓缩上Sephadex G-200分子筛凝胶柱，进行洗脱，收集活性部分，透析后冻干浓缩贮存，检测酶纯度，用于酶学性质的研究.
1.4 氢化酶的酶活分析
氢化酶活力测定采用以甲基紫精(MV)为电子载体,Na2 S2O4为电子供体的放氢反应体系.放氢反应体系包括 30-mmol/L的Tris-HCl 缓冲液(pH = 7.5),7.5-mmol/L MV,25-mmol/L Na2S2O4.反应总体积2-mL.活力测定在25-℃下进行,先在比色杯中加入30-mmol/L pH=7.5的Tris-HC1缓冲液(含7.5-mmol/L MV)1-mL,然后加入100-μL酶液,以加入 990-μL 30-mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5,含25-mmol/L Na2 S2O4 )为反应开始.使用紫外-可见分光光度计在 420-nm 下测定MV被还原后的光密度值.
一个酶活力单位定义为每分钟催化 1-μmol/L H2 的消化所需的酶量［5］.
1.5 酶催化反应的动力学性质的研究
1.5.1 酶的最适pH和酸碱稳定性
将酶液分别加在不同pH的缓冲液（pH 3.0~10.0）中，测定酶活力，确定最适pH，以酶活最高者为100%.将酶液用不同pH（pH=3.0~10.0）的缓冲液稀释，30-℃保温2-h，在最适反应pH下，测定酶的残余活力，以未保温的酶活力为100%.
1.5.2 酶的最适温度和温度稳定性
在pH-7.5条件下，测定不同温度20~50-℃对酶活力的影响，确定最适反应温度，以最大酶活力为100%.取一定量的酶液在不同温度下20~50-℃下分别保温0.5、1、1.5、2、2.5和3-h后迅速冷却至室温，在最适反应温度下测酶的残余活力，以最大残余酶活力为100%.
1.5.3 金属离子及抑制剂对酶活力的影响
在酶底物溶液中加入各种金属离子,并保持离子浓度为1-mmol/L,同时以不加金属离子的酶液作为对照测定氢化酶活性,计算相对酶活.在氢化酶底物溶液中分别加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和金属离子络合剂 EDTA,分别测定其在1-mmol/L浓度下的抑制情况.
2 结果和讨论
2.1 分离纯化的氢化酶
粗酶液经硫酸铵盐析、离子交换层析、分子筛凝胶层析这3步分离纯化的过程得到的回收率和纯化倍数见表1.
2.2 酶的纯度检测及分子量
经分离纯化的酶液脱盐、浓缩后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析［6］，结果见图1. SDS-PAGE显示2条带，说明该酶有2个亚基，根据SDS-PAGE标准蛋白的分子量及相对迁移率，计算出2个亚基的大小分别为62.0-ku和37.0-ku.因此，该酶是由两个亚基组成的二聚体，总分子量为99.0-ku.
2.3 酶的最适pH和酸碱稳定性
由实验结果可知,该酶的最适反应pH为7.5,在pH= 7.0～7.5酶的相对活力达到85 %以上(见图2).
同时pH= 7.0～8.0(30-℃保温2-h)酶的相对活力保持在80%以上,
而在pH= 3.0～6.5及pH= 8.5～10酶活力则损失较大(见图3), 说明该酶在pH= 7.0～8.0比较稳定.
2.4 酶的最适温度和温度稳定性
实验结果表明,随着温度的升高,酶活力不断增大,在30-℃时达到最大值,而后当温度继续升高时,酶活力反而下降(见图4).这是因为温度的升高加速了酶的催化反应速率,同时也加快了酶的热失活速率.在25-℃保温3-h酶活力基本没有损失(见图5), 30-℃保温2-h酶活力保留92.8%, 35-℃保温2-h酶活力保留79.2%,40-℃保温2-h酶活保留59.8%,随着保温时间的延长,酶活力不断下降,当温度高于50-℃时酶活力急速下降,说明该酶对高温较为敏感.
2.5 金属离子和抑制剂
金属离子Cu2+、Hg2+、Co2+对其活性有一定的抑制.酶活性不受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的作用,但受EDTA强烈抑制(表2).因此认为该酶属金属酶.
3 结论
此光合细菌的氢化酶经分离纯化后其纯化倍数，回收率为31.2%.对酶的性质研究结果表明该酶是由2个亚基构成的二聚体金属酶，酶催化活性的最适温度为30-℃，pH值为7.5，且在25~35 ℃和pH =7.0～8.0范围内较稳定.
参考文献:
［1］ VIGNAIS PM, BILLOUD B, MEYER J.Classification and phylogeny of hydrogenase［J］.FEMS Microbiol Rev,2001,25(4):455-501.
［2］GOGOTOV IN.Hydrogenase of phototrophic microorganisms［J］.Biochimie，1986，68（1）：181-187.
［3］CONRAD R.Biogeochemistry and ecophysiology of atmospheric CO and H2［J］.Advances in Microbial Ecology, 1988，10：231-283.
［4］李伟伟,刘均洪.氢化酶在生物技术中的应用［J］.化工生产与术,2005,12(2):26-29.
［5］FREY M.Hydrogenases:Hydrogen-Activating Enzymes ［J］.Method Enzymol,2002,3(2) :153-160.
［6］夏其昌.蛋白质化学研究技术与进展［M］.北京:科学出版社,1997.