川续断基因组DNA的提取研究

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摘要 川续断叶片中很有较多的蛋白质、多糖、酚类以及其他一些次生代谢物，采用传统的CTAB法很难得到高质量的DNA。试验以川续断叶片为材料，提出一种改良的CTAB法提取叶片基因组dna，对提取的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测及紫外分光光度计分析。利用中药材条形码ITS2序列的引物对提取的基因组DNA进行PCR验证。结果表明，改良的CTAB法得到的DNA质量较好，其OD260/OD280的值介于1.8～2.0之间，ITS2序列的引物PCR扩增成功率达到100%。改良的CTAB法为较为理想的川续断基因组DNA提取方法，获得的总DNA能够满足下游的PCR试验要求。

关键词 川续断；DNA提取；CTAB法

中图分类号 R282.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）02-0087-02

川续断（学名：Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai）为多年生草本，双子叶植物纲菊亚纲川续断目川续断科植物，高达2 m左右，生长在海拔1 200～2 500 m的高寒地区，具有耐寒喜湿等特点，为优良的中药原料；产于湖北、湖南、江西、广西、云南、贵州、四川和等省区；根入药，有行血消肿、生肌止痛、续筋接骨、补肝肾、强腰膝、安胎的功效。目前有关川续断分子生物学方面的研究报道较少，尤其是对于川续断基因组DNA的提取报道不多。高质量的基因组DNA提取对于下游的分子生物学实验至关重要，提取过程中为了获取纯度高、降解少以及浓度高的DNA样品通常在研究中根据不同的需要，采取相应的策略尽量排除其他大分子成分如蛋白质、多糖等的污染[1]。川续断属植物酚类、多糖类物质含量较高，难以获取高质量的DNA。采用传统的CTAB法提取的基因组DNA，产量低易降解，酚类物质不能有效地去除，无法达到预期要求。为此，在本研究中，在经典的CTAB法基础上，做了一定的调整优化，旨在获得提取高质量川续断DNA的方法，为后续的分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以川续断幼嫩新鲜的叶片为材料，其采集于恩施三岔乡、新塘乡以及石窑等地，采集的样品立即放入冰袋保存，带回室内-20 ℃冰箱备用。

1.2 主要仪器与试剂

PCR仪（Bio-Rad）、研钵、电泳仪（北京六一）、凝胶成像仪（北京六一）、-20 ℃冰箱、超纯水系统、制冰机、超速冷冻离心机（SIGMA）以及其他相关设备。DNA提取相关试剂均为国产，购自上海生工。

1.3 试验方法

1.3.1 川续断总DNA的提取以及纯度浓度检测分析。在参照各文献报道的DNA提取和改进方法[2-3]的基础上，采用改良CTAB法[4]提取9个产地川续断叶片的总DNA，其具体试验步骤如下：取2～3 g叶片，放入液氮预冷的研钵，迅速研磨至粉末状，转移至10 mL离心管，加入6 mL的除酚缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），50 mmol/L EDTA-Na（pH值8.0），0.7 mol/L NaCl，2%（w/v）PVP40，用前添加2%（W/V）β-巯基乙醇]，涡旋振荡2～3 min后冰浴30 min，随后5 500 r/min离心15 min；弃上清液后，再次加入6 mL除酚缓冲液，涡旋混匀后冰浴静置15 min，5 500 r/min离心15 min，弃掉上清液；向沉淀中加入4 mL预热的CTAB提取缓冲液[3%（w/v）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaC1，1%（w/v）PVP40，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2%]，65 ℃水浴1.5 h，期间颠倒混合2～3次，取出冷却至室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀2 min，11 000 r/min离心10 min，若上清液比较黏稠，可重复该步骤1次；离心后，小心吸取上清液至新的离心管中，加入1/2体积的5mmol/L NaCl以及2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀；-20 ℃静置2.5 h后，11 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，用70%乙醇以及无水乙醇各洗1次后，将离心管重新放入离心机，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，用移液器吸取残留的乙醇，将含有沉淀的离心管放入超净工作台吹干5～10 min，以无乙醇气味为止。随后加入适量的灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，待DNA完全溶解后加入1～2 μL的RNaseA（10 mg/mL），37 ℃保温1 h以出去RNA，于离心管中加入1 mL氯仿∶异戊醇（24∶1）轻轻上下颠倒10 min后11 000 r/min离心10 min。吸取上层水相并先后加入1/2体积5 mmol/L的NaCl及2倍体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20 ℃冰箱，10 min后11 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入70%乙醇洗涤2～3次，风干，最后将DNA溶于适量（50～100 μL）灭菌ddH2O中，分装后-20 ℃保存备用。

基因组DNA纯度检测：取5 μL提取的DNA溶液，加入1 μL 6×loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为0.5×TBE电泳缓冲液，1%的琼脂糖凝胶（0.01% 10 000×DNA Green染色），电压160 V，时间45 min左右；电泳后，使用凝胶成像系统进行观察拍照。

DNA样品浓度检测：采用紫外分光光度计测定DNA样品在260、280 nm处的吸收值，计算其浓度。

1.3.2 PCR扩增产物检测分析。以提取的8个产地川续断基因组DNA为模板，采用中药材ITS2条形码通用引物进行PCR扩增[5-6]。引物序列为ITS2-2F：5′-GCGATACTTGGTGTG AAT-3′，ITS2-3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；反应体系为25 μL，其中：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（2.5 μmol/L）各1 μL，模板DNA 3 μL，加ddH2O至25 μL。

2 结果与分析

2.1 川续断基因组DNA纯度检测

使用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行分析，分别测定样品在260、280 nm波长下的吸光度，结果见表1。由表1可知，改良的CTAB法提取的DNA，其A260/A280值介于1.8～2.0之间，表明提取的总DNA质量较好，无多糖、蛋白以及酚类污染。

2.2 川续断基因组DNA的琼脂糖电泳检测

图1为改良的CTAB法提取的川续断DNA琼脂糖电泳检测结果。可以看出，改良的CTAB法提取的DNA亮度均匀一致，条带较清晰整齐，无明显拖尾产生，点样孔无亮带出现，说明提取的DNA没有降解，完整性及纯度较好，无多糖、蛋白质以及酚类污染。

2.3 PCR扩增检测

使用候选条形码基因ITS2的通用引物对所提取到的DNA样品进行扩增，扩增结果见图2。由图2可知，8个产区提取的DNA样本均能扩增出均匀一致，清晰明亮的条带，扩增成功率100%，说明改良的CTAB法提取的基因组DNA纯度较好，无PCR反应抑制物存在，可以进行下游的PCR相关试验。

3 讨论

目前，有关植物基因组DNA的提取方法很多，大多是比较成熟的方法，但是对于不同类型的植物，由于其自生的代谢物质含量和类型的不同，导致在实际操作中存在一定的不同。植物通常富含蛋白质以及酚类、多糖等次生代谢物质，严重地干扰了DNA的提取。能否有效去除这些代谢物的干扰是提取高质量DNA的关键因素。有研究表明，CTAB 缓冲液比较适合于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物[7-8]。

针对川续断富含多糖、酚类物质的特点，本研究对传统的CTAB法做了一定调整。在液氮研磨后，样品粉末首先用不含CTAB的除酚缓冲液进行处理，去除过多的酚类物质，减少后续DNA沉淀过程中出现褐变的情况。其次，适当延长CTAB缓冲液的裂解时间，使细胞破碎裂解更加充分，释放出更多的DNA。最后，向氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提后的水相中加入0.5倍体积5 mol/L的NaCl和2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，进一步除去残留的多糖物质。试验对提取的DNA进行PCR扩增验证，发现扩增成功率达到100%，扩增条带清晰明亮，均匀一致，说明该方法提取过程中的多糖、蛋白质以及酚类物质去除的比较干净，减少了对PCR反应中Taq聚合酶活性抑制以及模板结合的干扰影响。总的来看，改良的CTAB法效果比较好，提取的DNA纯度较高，可以满足后续的分子生物学实验。

4 参考文献

[1] 袁云香，李海娟.水稻基因组DNA提取方法的研究进展[J].湖北农业科学，2010，49（4）：968-971.

[2] 曾杰，邹喻苹.顽拗植物类群的总DNA制备[J].植物学报：英文版，2002，44（6）：694-697.

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[4] DOYLE J J.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem bull，1987，19：11-15.

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[8] 苏前，吕杰，任曼丽，等.硅胶干燥罗布麻叶片DNA提取及RAPD反应体系建立[J].新疆农业科学，2013，50（3）：524-529.