传统酸肉中可降低胆固醇乳酸菌的分离筛选及鉴定
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摘要 通过不同培养基筛选传统酸肉中能够降低胆固醇的乳酸菌，并对其进行鉴定。结果表明：有36株降胆固醇乳酸菌从传统发酵酸肉中分离出来，其中菌株CT24的降胆固醇能力最强，胆固醇降低率达31.23%，对应降胆固醇的量为62.89 ？滋g/mL。经对菌株CT24进行形态学观察、生化指标鉴定，初步确认该菌为消化乳杆菌。
中图分类号 TS251 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）03-0238-01
Abstract The Lactobacillus which could reduce cholesterol was screened by different culture media from traditional acid meat.The results showed that there were 36 strains Lactobacillus which separated from traditional acid meat，and cholesterol reducing ability of the strain CT24 was the strongest，the cholesterol reduction rate was up to 31.23%，and the amount of cholesterol reduction was about 62.89 ？滋g/mL.After the morphological observation and biochemical identification of the strain CT24，it was confirmed that the bacteria were Lactobacillus.
Key words traditional acid meat；cholesterol reducing Lactobacillus；isolation；screening；identification
生活在我贵州省荔波县一带的布依族，有一种独特的食肉方法，即用生鲜猪肉腌制酸肉，每片肉上略带几粒米或花椒颗，味清香，食之皮脆，肉鲜，酸味适中，香气四溢，清爽上口，无油腻感。有相关研究表明，这种经过传统发酵后的猪肉中滋生着大量的微生物。本研究旨在纯化这些微生物，以寻找具有能够降低胆固醇的乳酸菌株。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材与试剂。传统酸肉，购自贵州省荔波县农贸市场。供试试剂：生理鉴定用麦芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖等糖（醇）类药品均为分析纯，购自天津制药有限公司；牛血清白蛋白、蛋白胨等（生化试剂），上海博星生物技术有限责任公司提供；肌醇等（生化试剂）、考马斯亮蓝G-250等（均为分析纯），胆固醇、磷酸氢二钾，天津市富龙化工试厂提供。
1.1.2 供试仪器与设备。超净工作台（苏州净化设备有限公司）、高压灭菌锅（上海中安医疗器械厂）、电热恒温培养箱（上海恒科技有限公司）、722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、pH计（梅特勒一托利多仪器有限公司）、光学显微镜（重庆光学仪器厂）。
1.1.3 试验用培养基。分离培养基：MRS培养基、改良MC培养基；鉴定培养基：葡萄糖产气试验用培养基、胆固醇胶束高胆固醇培养基（高胆固醇培养基Ⅱ）、PY培养基、鸡蛋高胆固醇培养基（高胆固醇培养基Ⅰ）、明胶基础培养基、硝酸盐还原试验培养基、MRS液体培养基、碳水化合物发酵产酸试验用培养基、碳酸钙-MRS固体培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 胆固醇含量的测定。参照《食品中胆固醇的测定》（GB/T 5009.128―2003）进行胆固醇含量的测定。以吸光度（A560 nm）为纵坐标，胆固醇标准溶液质量浓度为横坐标，得到y=0.005 9x-0.007 8（R2=0.991 6）的标准曲线。
1.2.2 乳酸菌的分离鉴定。乳酸菌的分离参考《食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35―2010）方法实施。参照《乳酸细菌分离鉴定及实验方法》以及《伯杰细菌鉴定手册》第八版对筛选到的菌株进行鉴定。
1.2.3 筛选菌株降胆固醇作用初步研究。
（1）粗酶液提取[1-2]。收集CT24菌株培养的上清液和菌体沉淀液，分别对其进行浓缩和离心，然后向其中添加体积分数为0.4%、0.6%、0.9%、1.2%、1.6%、2.0%的TritonX-100，4 ℃条件下静置4～5 h，分别检测上述上清液的酶活力和蛋白质的含量；分别取等量的8份上清液分别添加能使溶液饱和度达到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸铵进行静止沉淀，4 ℃条件下静置过夜后弃去上清液，检测沉淀的酶活力和蛋白质含量。
（2）酶活力测定。将胆固醇溶液、酶溶液、ATP盐溶液放入具塞试管中，振荡混匀后在37 ℃水浴中反应15 min左右，测定560 nm吸光度值，再根据标准曲线方程得到胆固醇含量，以被酶降解的胆固醇量反映酶活力。酶活力计算公式如下：
酶活力（U/mL）=
式中：K为酶溶液稀释倍数；m为转化胆固醇（？滋g）；V为液体容积（mL）；T为反应时间（h）。
（3）蛋白质含量测定。蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法来测定。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离及降胆固醇乳酸菌的初筛
在碳酸钙培养基上挑选出具有典型乳酸菌菌落形态的菌株，在37 ℃条件下静置培养24～48 h，划线纯化3代后进行革兰氏染色镜检。
将36株经纯化的乳酸菌菌株分别标识为CT1―CT36，加入高胆固醇培养基Ⅰ进行培养，测定胆固醇降低情况，未添加菌种的培养液中胆固醇量为201.37 ？滋g/mL，菌株CT24胆固醇降低率达31.23%，对应降胆固醇的量为62.89 ？滋g/mL，其他菌株降低胆固醇的量极低，均低于12%。
2.2 筛选菌株的形态学鉴定
将筛选出的CT24菌株在MRS培养基平板上划线纯化，并对其进行显微镜观察，结果显示其个体形态为细胞杆，G+，菌落乳白色，边缘湿润光滑，不透明。
2.3 筛选菌株的生理生化性质
对筛选菌株CT24生理生化进行鉴定，结果见表1。
2.4 筛选结果
参照《乳酸细菌分离鉴定及实验方法》以及《伯杰细菌鉴定手册》[3]第八版，初步鉴定CT24为消化乳杆菌。
3 结论
该研究筛选出一株有较强降低胆固醇能力的乳酸细菌――消化乳杆菌。该菌株来自于食用安全较高的传统酸肉，同时该菌株能够符合作为发酵肉制品发酵剂的主要特征[4-10]，具有潜在的工业化推广的价值。但是该菌株能够降低胆固醇的原理尚不明确，需要进一步研究[11-14]。
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