小鼠胚胎显微操作针的徒手制作及使用方法
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摘要：随着人类的进步，越来越多的学者开始探索显微操作领域，而显微操作针是必备工具之一，显微操作针的制作技术则显得尤为重要。本文结合笔者实验摸索经验，将小鼠胚胎显微操作针的徒手制作及使用方法介绍如下，以供实验参考。
关键词：小鼠胚胎；显微操作针；制作及使用
随着科学的发展，显微操作被广泛应用于胞浆内注射（ICSI）[1]、转基因动物[2]、克隆动物[3]、辅助生殖技术[4]等等。本文结合笔者长期实验摸索经验，本着既可顺利完成实验任务又可将成本降至最低的原则，现将小鼠胚胎显微操作针（持卵针与注射针相结合）的徒手制作及使用方法总结如下。
1资料与方法
玻璃直形点滴管（上海化科实验器材有限公司，中国）、酒精灯、5～10ul移液枪枪头（北京天宇祥瑞科技有限公司，中国）、1ml注射器、一次性使用静脉输液针、封口膜（Parafilm M Laboratory Film）（上海华雅思创生物科技有限公司，中国）、直头手术剪或眼科剪。
1.1显微操作针的制作方法 准备玻璃直形点滴管，使用前先将点滴管置于1mol/l的氢氟酸溶液中浸泡24h，然后用超纯水（UP）连续冲洗数次，直至冲洗出来的水的PH值为中性，反复甩干多次后将玻璃直形点滴管置于120℃的烘箱中烘干及消毒4h，最后将其储存在一个干燥密封且用75%乙醇清洗过的塑料容器内备用。
1.2徒手拉针 于实验室操作台上点燃酒精灯，戴上一次性无菌手套，选取一根准备好的玻璃直形点滴管。双手各持玻璃直形点滴管的一端，置于酒精灯上煅烧，待点滴管渐渐融化变软时，双手保持在一水平线上并同时向相反方向用力牵拉，即可徒手拉制成功显微操作的操作针。刚拉制的操作针针尖一般过细而近似堵塞，故此时需用直头手术剪或眼科剪将部分针尖头剪断，具体剪断多少以调试可以正常使用为准。
1.3显微操作针的组装 将徒手拉制好的操作针针尾与消毒好的5～10ul移液枪枪头尾部相连接；打开一次性使用静脉输液针的包装，剪去其针的部分而保留管的部分，再将剪的那端与上一步中的移液枪枪头尖部相连接；再将一次性使用静脉输液针尾端与1ml注射器相连接，这样就成功徒手制作出小鼠胚胎显微操作针。
2显微操作针的使用方法
2.1移卵操作 显微操作针移取胚胎时，在吸入胚胎前应先吸入少量干净的培养液，再吸入少量空气，吸微量培养液，后吸取胚胎，可减少拉制后点滴管的虹吸作用，以避免把胚胎吸入到移卵管内而导致胚胎损失，这样也有助于避免当胚胎从移卵管打出时出现气泡。当胚胎被打入到培养微滴时，不要把所有的培养液都打出去，否则可能会在培养微滴中产生大量的气泡，而影响胚胎的正常生长。
2.2移植操作 显微操作针移植胚胎时，需要两人配合操作，实验人员A准备好需要移植的假孕雌鼠，于显微镜下背部开口牵扯出子宫，并在移植位点（采取宫管结合部下0.5cm～1cm处）用1ml注射器针头刺孔备用；与此同时，实验人员B于微滴中吸取所需移植胚胎（方法同移卵操作），该过程需尽可能吸取少量液体，且避免针尖部吸入空气，否则将在一定程度上影响胚胎正常着床率；待吸取好实验要求胚胎数后，B将操作针交由A控制，A将针尖插入备用好的刺孔中，注意针尖与子宫保持在一条直线上，然后嘱B缓慢推动注射器活塞，待液体全部打进小鼠子宫后拔出操作针。此外，若推动注射器活塞后发现操作针内液体不动，说明针尖部在小鼠子宫内堵塞导致压强过高，此时稍微向外抽动针尖或调整针尖方向使针尖部压强减弱即可，切忌拔出针尖重新插入，以免针尖部培养液外流导致胚胎损失。
2.3用后保存 每次使用后，需用超纯水（UP）涮洗3～5遍，以洗去针尖部残存细胞培养液或涮洗液，防止下次使用时堵塞针尖。涮洗后的操作针放入干燥箱干燥备用，待下次使用前20～30min取出置于超净台内，用紫外线照射20min左右以保证无菌操作使用。
3讨论
显微操作针的质量直接影响到转基因动物的成功率[5]。据相关报道，多数研究人员购买拉针仪与烧针仪来制备显微操作的持卵针与注射针（即移卵针），无论通过何种方式，制备好的注射针都要试注射才能确定其是否适用[6]。然而，在都能适用且可顺利完成实验的前提下，节约实验成本就显的尤为重要。
小鼠胚胎显微操作针的徒手制作及其使用方法简单易学，且经实验操作试用，能够顺利完成课题要求任务。该方法也存在着不足。一方面，简单的制作流程可以在短短几分钟内即可制作出得心应手的操作针，它既可以当持卵针取胚胎亦可作为注射针进行胚胎移植，这样以来就为实验节省了大量的宝贵时间；在很大程度上节省了实验经费的开支。另一方面，徒手制作的显微操作针较之精密设备制成的，则显得较为粗糙，实用性上可能也略逊一筹，在某种程度上可能会影响到实验的进度。
参考文献：
[1]Gou KM，An XR，Tian JH，et al.Sheep transgenic embryos produced by intracytoplasmic sperm injection[J].Acta Biologiae Experimentalis Sinica，2002，35（2）：103-108.
[2]Robl JM，，Wang Z，Kasinathan P，et al.Transgenic animal productionand animal biotechnology[J].Theriogenology，2007，67（1）：127-133.
[3]Laible G，Brophy B，Knighton D，et positional analysis ofdairy products derived from clones and cloned transgenic cattle[J].Theriogenology，2007，67（1）：166-177.
[4]张丽红，王秋菊.辅助生殖实验室技术研究进展[J].国外医学（计划生育分册），2004，23（1）：30-34.
[5]廉莉，李光鹏，廉颖，等.实验用显微操作针的制备与应用[J].生殖与避孕，2003，23（1）：56-58.
[6]NagyA，Gertsenstein M，Vintersten K，et al.Manipulatingthe Mouse Embryo：A Laboratory Manual[M].The 3th edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2003：263-300.