异氟烷对间歇缺氧静脉内皮细胞的保护作用研究
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[摘要] 目的 探讨异氟烷对间歇缺氧（IH）人脐静脉内皮细胞的作用。 方法 HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组及1%、1.5%、2%异氟烷预处理组，测定细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）水平，采用Real-time PCR和Western blot法检测低氧诱导因子（HIF-1α）和核转录因子-B（NF-κB）的表达。 结果 与对照组比较，模型组细胞活力、SOD活性和GSH水平降低，LDH活性、MDA含量、HIF-1α和NF-κB表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，异氟烷预处理组的细胞活力、SOD活性、GSH水平和HIF-1α表达，增加LDH活性、MDA含量和NF-κB表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 异氟烷能清除细胞氧自由基，上调HIF-1α表达，下调NF-κB表达，提示其能降低IH引起氧化应激和炎性反应，减轻内皮细胞IH损伤。
[关键词] 异氟烷；人脐静脉内皮细胞；间歇缺氧；氧化应激；炎症
[中图分类号] R614.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（c）-0028-05
[Abstract] Objective To study the effect of isoflurane on intermittent hypoxia （IH） injured human umbilical vein endothelial cells. Methods HUVEC and EAhy926 cells were divided into control group， model group， 1%， 1.5%， 2% Isoflurane pre-treatment group. Cell viability， MDA and GSH levels， LDH and SOD activities， and HIF-1α and NF-κB expressions were tested by MTT assay， expression of MDA， LDH， SOD and GSH were tested by Real-time PCR and Western blot， respectively. Results Compared with control group， the cell viability， SOD activity and GSH level decreased， LDH activity and MDA level， and expression of HIF-1α and NF-κB increased in model group cells， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with model group， the cell viability， SOD activity， GSH level and HIF-1α expression increased， MDA level， LDH activity and NF-κB expression decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01） Conclusion Isoflurane protects human umbilical vein endothelial cells from IH injury by scavenging free radical and reducing oxidative stress and inflammation.
[Key words] Isoflurane； Human umbilical vein endothelial cells； Intermittent hypoxia； Oxidative stress； Inflammation
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是睡眠时上呼吸道反复阻塞的一种疾病[1]，为高血压、冠心病和心肌梗塞等诸多心脑血管疾病相关的独立危险因素[2-3]，二者关系的研究逐渐成为目前研究热点。间歇缺氧（intermittent hypoxia，IH）导致的氧化应激和炎性反应造成的血管内皮损伤是OSAS引起心脑血管疾病的主要原因之一[4]。临床常用异氟烷可抑制氧自由基生成，降低脏器缺血再灌注损伤[5]，但其对细胞IH的作用鲜见报道。本研究探讨异氟烷对IH脐静脉内皮细胞的作用。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
人脐静脉内皮细胞HUVEC和EAhy926（中科院上海细胞生物学研究所）；DMEM培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；BCA试剂盒、白提取试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；抗体（Santa Cruz公司）；PVDF膜和ECL化学发光试剂（Millipore公司）；TRIzol试剂盒和逆转录试剂盒（Invitrogen公司）。
1.2 分组及处理方法
HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组和1%、1.5%、2%异氟烷预处理组。对照组细胞正常培养；IH模型细胞参照Hoffmann等[6]的方法，于5% CO2和95% N2（O2
1.3 MTT法测定细胞活力
细胞以1×105个/mL接种于96孔板，同“1.2”项方法培养，加5 g/L MTT 20 μL培养4 h，弃培养基后加DMSO 150 μL溶解结晶。用全自动酶标仪检测490 nm吸光度。重复3次。
1.4 GSH水平、LDH活性及MDA含量测定
细胞培养液离心后取上清，按相应试剂盒说明书测GSH水平、LDH活性和MDA含量，重复3次。
1.5 SOD活性测定
细胞用0.25%胰酶消化，离心，PBS溶解沉淀，超声破碎，按SOD试剂盒说明书测SOD活性，重复3次。
1.6 Real-time PCR检测
TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，定量PCR扩增，扩增体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA，ddH2O 7 μL。反应条件：94°C，2 min；94°C，30 s；62°C，30 s，30个循环；72°C，5 min。低氧诱导因子（HIF-1α）上下游引物为5'-ATCTGAGGACACGAGCTGCCT-3'和5'-CAGAAGGACTT-GCTGGCTGATC-3'，产物368 bp；核转录因子-B（NF-κB）上下游引物为5'-CTGATGTGCACCGACAAGTGG-3'和5'-GTT-GATGGTGCTC-AGGGATGAC-3'，产物353 bp。各样品复管2次。β-actin为内参。基因表达量由2-ΔΔCt法获得。
1.7 Western blot检测
Trizol抽提细胞总蛋白，用白提取试剂盒提取白，BCA法测蛋白浓度。10 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离并转膜，封闭1 h，分别加入HIF-1α、NF-κB、GAPDH或TBP一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加二抗，室温孵育2 h，GAPDH为HIF-1α的内参，TBP为NF-κB的内参，用ECL系统进行化学发光和观察。重复3次。
1.8 统计学方法
采用统计软件SPSS 22.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异氟烷增加IH内皮细胞存活力，降低LDH活性
与对照组比较，模型组吸光度值降低，LDH活性均升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较难，随着异氟烷浓度的增加吸光度值增加，LDH活性下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。
注：与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；LDH：乳酸脱氢酶
2.2 异氟烷降低IH内皮细胞MDA含量
与对照组比较，模型组MDA含量增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，随着异氟烷浓度的增加MDA含量降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、图2。
2.3 异氟烷升高IH内皮细胞SOD活性和GSH水平
与对照组比较，模型组培养基中SOD活性和GSH水平显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），异氟烷预处理显著升高SOD活性和GSH水平，差异有统计学意义（P < 0.05），且随着异氟烷浓度的增加SOD活性和GSH水平均升高。见表3、图3。
2.4 异氟烷对IH内皮细胞HIF-1α和NF-κB表达的影响
qRT-PCR和Western blot结果表明：与对照组比较，模型组HIF-1α和核内NF-κB均高表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，随着异氟烷浓度的增加内皮细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），而NF-κB mRNA和蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4、5。
3 讨论
OSAS机体处于IH环境中，产生大量氧自由基，形成氧化应激状态[7]。OSAS可导致诸多心脑血管疾病，病理基础是血管内皮受损，而IH是引起血管内皮受损的核心环节[8]。本实验用HUVEC和EAhy926细胞IH模拟OSAS IH，模型组吸光度降低，LDH活性升高，表明细胞氧化呼吸功能受损，细胞膜通透性增加。
全身麻醉后OSAS患者术后呼吸系统并发症风险很高[9]。麻药的选择对OSAS患者的安全至关重要。异氟烷是临床常用挥发性卤代[10]，具有抗氧化的特性，保护细胞DNA损伤[11]。异氟烷预处理对多种器官可产生保护作用。据报道，异氟烷对脑[12]、心脏[13]、心肌[14]、肾[15]、肝和肺[16]等器官缺血再灌注损伤均有保护作用。鉴于缺血再灌注与IH有相似之处，本研究探讨异氟烷对IH内皮细胞的作用，发现异氟烷预处理可降低细胞IH损伤。血管内皮细胞功能异常是引发心血管疾病的关键，内皮细胞缺氧可产生大量活性氧，损伤血管。异氟烷可提高IH脐静脉内皮细胞SOD活性和GSH水平，降低氧自由基，保护细胞。
OSAS合并心脑血管疾病发病机制复杂，NF-κB依赖的炎性通路和HIF-1依赖的适应性通路尤为重要[17-18]。NF-κB在胞浆内与IκB结合，无活性；受到炎症介质和应激反应等刺激后解离，NF-κB活化入核，促进炎症因子转录。据报道IH可升高EAhy926中NF-κB表达[19]。HIF-1广泛存在于人和哺乳动物细胞内，低氧时才稳定表达[20]，能激活200多个基因调控缺氧应答[21]。HIF-1由受缺氧调控的HIF-1α和细胞内稳定表达的HIF-1β组成，只有二聚体才能发挥作用。缺氧时HIF-lα表达增多，与HIF-1β结合入核，激活促血管内皮生长因子、促红细胞生成素和一氧化氮合酶等基因转录[22]。HIF-1α可降低缺血再灌注损伤中线粒体氧化应激的产生，其下游效应因子已糖激酶Ⅱ也可阻止缺血再灌注损伤造成的线粒体功能障碍[22]。结果发现：IH HUVEC和EAhy926细胞HIF-1α和核内NF-κB表达升高，而异氟烷预处理能够升高细胞HIF-1α表达，降低NF-κB表达，提示其可抑制氧化应激所致的炎症损伤。
综上所述，异氟烷可降低细胞IH损伤，为其用于OSAS患者的麻醉提供依据。然而异氟烷在降低细胞IH损伤的同时，是否有其他副作用，还有待深入研究。
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（收稿日期：2016-01-23 本文编辑：苏 畅）