高效苯酚降解菌的分离鉴定

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摘 要 目的：从重度酚类污染的土壤样本中筛选、鉴定高效降酚菌，对该菌株在不同苯酚浓度下进行降酚能力的考查。方法 采用以苯酚为唯一碳源、逐量分批的方法驯化、分离苯酚降解菌株，利用形态学、培养特性、生理生化反应以及设计引物检测16SrDNA序列鉴定菌株。结果：筛选到一株高效苯酚降解菌，鉴定归属为不动杆菌属，该菌株48h内对苯酚（2.0g・L-1）的降解率为85.93%。结论：经过实验室驯化及降酚条件优化，所得菌株具有良好的降解苯酚性能。

关键词 苯酚降解菌 驯化 分子鉴定

中图分类号：X172 文献标识码：A

当今社会工业化程度的提高使许多工厂大量排放含酚废水及污染物。酚类化合物属芳香族化合物，对人体有毒害作用，比如对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可引起肝或肾损害，还可引起不同程度的头痛、咳嗽、恶心、呕吐等等。

治理含酚废水最有效的方法是控制污染源，首先是加强企业的管理，使其自觉的对含酚废水采取有效处理、回收以及综合利用；其次是合理选择工艺流程、开发无公害工艺、无公害催化剂、使用无公害试剂的反应实现清洁工艺技术；第三是寻找高效率、合适的降低废水中的含酚浓度的方法。

生物法治理含酚废水较其它方法比有能耗少、处理效率高、二次污染少等优点。近些年来对于直接用于高浓度含酚废水的降酚菌研究有限，本研究旨在驯化、分离、筛选出能够适用于工业上降解高浓度含酚废水的菌种。

1 材料与方法

1.1 培养基

（1）唯一碳源培养基：苯酚终浓度分别为0.5g・L-1至2.0g・L-1。（2）富集培养基 蛋白胨10. 0g・L-1，牛肉浸膏5. 0 g・L-1，NaCl 5. 0 g・L-1，pH7. 0。（3）富集（分离）固体培养基：苯酚浓度若干、琼脂浓度为15.0 g・L-1。

1.2 实验方法

（1）降酚菌的分离与纯化。取一定量污染土样的蒸馏水稀释液涂布于含有苯酚的分离固体培养基梯度平板上。30℃培养36～48h。选取生长在苯酚浓度较高区域并且形态较好的细菌单菌落，于分离固体斜面培养基上扩大培养。

（2）降酚菌株的驯化、筛选。将上文所得菌株接入含0.5 g・L-1苯酚的唯一碳源培养基中，30 ℃，pH7.0，150 r/ min 振荡培养18～24 h。重复上述培养过程，直至苯酚浓度达到2.0 g・L-1，选取单位时间内降酚率较大的菌株。

（3）降酚菌生长量的测定及苯酚浓度的测定。以OD 600nm代表该菌体的生长状况，采用4-氨基安替吡林法测定苯酚浓度。

（4）苯酚降解率的计算。降解率（%） = （1-反应后苯酚浓度/ 苯酚起始浓度） 00 %

（5）不同苯酚浓度下降酚菌株的降酚能力考查。将处在对数生长期的菌液按5%的接种量接入含苯酚浓度分别为0.5g・L-1、1.0g・L-1、1.5g・L-1、2.0g・L-1的唯一碳源培养基中，30℃，pH7.0，150r・min-1培养，计算48h内苯酚降解率。

（6）苯酚降解菌的鉴定。①传统方法鉴定：通过降酚菌株的个体和菌落特征、生长状况、革兰氏染色以及生理生化反应初步鉴定该菌株。②分子鉴定：设计细菌的16SrDNA序列通用引物，扩增其16SrDNA序列，引物序列F1：5′CCCAAGCTTGGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，F2：5′CGGAATTCCGTACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，扩增条件94℃、3min；（94℃、30sec；52℃、30sec；72℃、1 min）30个循环；72℃、5min；4℃保存，测序。

2 结果

2.1 菌株的分离筛选

经过分离筛选，共挑取100株耐酚菌株，选取其中降酚率较高且遗传稳定的一株菌（DY-009）作后续研究。

2.2 不同苯酚浓度下降酚菌株的降酚能力

48h内对苯酚浓度为0.5g・L-1、1.0g・L-1、1.5g・L-1、2.0g・L-1降解率分别为96.52%、95.08%、92.16%、85.93%。

2.3 菌株的鉴定

菌株DY-009显微形态为杆状，菌落圆形，表面及边缘光滑整齐，颜色为淡黄色，革兰氏染色呈阴性。

菌株DY-009的16SrDNA序列长度为1457bp，利用blast软件将DY-009的16SrDNA序列与Genebank中已报道的16SrDNA序列进行同源性比较，结果表明菌株DY-009的16SrDNA序列与在Genebank登记的多株不动杆菌属的菌株具有高度的同源性（≥96%）。经过序列比对，目的分离株位于Acinetobacter这一分支中，与其临近的一株登记号为NR_025412.1的Acinetobacter schindleri strain LUH5832菌株16SrDNA序列的同源性达到98%。

结合显微和菌落鉴定结果、生理生化反应、分子鉴定，将DY-009归属为不动杆菌属。

基金项目：内蒙古医科大学大学生科技创新基金项目（2014YCPY011）；内蒙古医科大学2014年度实验室开放基金项目（KFSYSZN201418）。