缺血性心脏病患者外周血中内皮祖细胞数量和功能的变化

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【摘要】 目的：观察缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)患者外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)数量及功能的变化。方法：IHD患者和对照者各23例，用密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞，用流式细胞仪测量外周血中CD+细胞以鉴定EPCs。分别观察EPCs的粘附能力、迁移能力和体外生成血管能力。结果：IHD患者外周血中EPCs数量明显低于对照组，其粘附能力、迁移能力和体外生成血管能力也明显受损。结论：IHD患者外周血中EPCs数量降低且功能减退。

【关键词】 缺血性心脏病； 内皮祖细胞； 数 量; 功 能

慢性心力衰竭为多发病，发病率还在上升。缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是慢性心力衰竭的主要原因，早期重运重建显著降低早期死亡率，但不能修复坏死的心肌。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)移植治疗IHD, 不仅可以再生血管,而且可以再生心肌, 使人们看到了治疗IHD的新希望［1］。我们观察了IHD患者外周血中EPCs数量及功能的变化。

1 资料与方法

1.1 临床资料：IHD组23例，男13例、女10例，年龄(66.5±7.4)岁，均有胸痛，冠脉造影证实至少一支冠脉狭窄>5O% ，其中单支病变7例，2支病变7例，3支病变9例。另选23例作为对照组，男12例、女11例，年龄(66.1±8.4)岁，入选者均有胸痛病史，冠脉造影未见狭窄性病变。两组性别、年龄、吸烟、血脂、糖尿病等临床资料无统计学差异。

1.2 EPCs的分离、培养和鉴定：采用密度梯度离心法从患者外周静脉血中分离单个核细胞并在包被有HFN 的24孔培养板中培养。EBM-2培养基培养4d，换培养液继续培养至d7，分析贴壁细胞。贴壁细胞用DiLDL(2．4 ug／ml)在37℃温育1 h。然后用2％多聚甲醛固定10min。再用FITC-UEA-I(10ug／ml)温育1 h。双染色阳性者为正在分化的EPCs，2～3个观察者每孔随机选取3个200倍视野计数EPCs。流式细胞仪分析：取100 ul外周血用PE标记的CD34抗体避光温育15 min，同型抗体做阴性对照，分析100 000个细胞。

1.3 粘附能力检测：用0．1%胰蛋白酶消化、收集EPCs，悬浮于500ul EBM-2培养基中计数。然后将同等数目的EPCs接种在包被有人HFN的24孔培养板，37℃下培养30 min，计数贴壁细胞。

1.4 EPCs迁移能力检测：用0．1% 胰蛋白酶消化、收集EPCs，悬浮在500ul EBM-2培养基，计数。将500ul EBM-2培养液加入改良的Boyden小室的下室，2×104 EPCs悬浮在50ul EBM-2培养基注入上室。37℃ 培养24 h，刮去滤膜上面未移动的细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择3个显微镜视野，计数迁移到底层的细胞。

1.5 体外血管生成能力检测:在200倍倒置显微镜下观察小血管生成情况,随机选择10个视野计数。细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小血管。

1.6 统计学方法：数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05被认为有统计学差异。

2 结果

2．1 两组EPCs数量比较：以流式细胞仪计数CD34+细胞所占比例作为外周血中EPCs数量，IHD组比对照组显著降低(0．033±0．006 vs 0．039±0．007 )% ，P<0．05。倒置荧光显微镜下计数双染色阳性者，即正在分化的EPCs数量，IHD组为(159±37)个／视野，对照组为(239±48)个／视野，两组比较有显著差异(P<0．05)。

2．2 两组EPCs功能比较：两组EPCs粘附、迁移、血管生成细胞比较，发现IHD组比对照组EPCs功能显著降低，见表1。

表1 两组EPCs粘附、迁移、血管生成细胞比较（略）

与对照组比较，P<0．05

3 讨论

最近研究发现存在于外周血中的内皮祖细胞可能参与出生后的血管新生和损伤血管的再内皮化过程，对内皮修复、维持血管稳定有利的生物学功能具有重要作用。一些研究发现在组织缺血、血管损伤、心血管危险因素、严重烧伤等病理性刺激及药物作用下循环EPCs数量可发生变化［2］。

本研究发现，IHD患者外周血中EPCs数量明显低于对照组，其粘附能力、迁移能力和体外生成血管能力也明显受损。 此外，我们观察到随着冠状动脉病变程度的加重，EPCs水平逐渐降低，提示IHD的发生及冠状动脉病变程度可能与循环EPCs数量减少有关。EPCs数量减少及功能损伤可能导致IHD患者冠状动脉自身修复能力降低与缺血心肌新生血管减少。本研究也发现，有高血压、糖尿病、吸烟、冠心病家族史、血脂异常等综合危险因素的患者循环EPCs水平较对照组降低，而吸烟与循环EPCs数量减少相关性最密切。冠心病危险分数与循环EPCs水平呈负相关，这与文献报道一致。冠心病危险因素使循环EPCs数量减少的原因目前尚不清楚，可能与其促进EPCs凋亡、干扰调节EPCs分化动员的信号通路有关。

内皮祖细胞移植治疗IHD, 不仅可以再生血管,而且可以再生心肌, 使人们看到了治疗IHD的新希望。通过不断探讨IHD患者内皮功能及内皮祖细胞数量与功能的改变，可以为冠心病的细胞及分子水平的治疗提供新途径［3，4］。

【参考文献】

［1］ Assmus B., Honold J., Sch?chinger V.,et al. Transcoronary Transplantation of Progenitor Cells after Myocardial Infarction［J］. N Engl Med， 2006，355:1222-1232.

［2］ 崔斌,黄岚,宋耀明，等.冠心病患者循环内皮祖细胞与相关危险因素及冠状动脉病变的关系［J］.中华心血管病杂志，2005，33:785-788.

［3］ Prockop, D. J., Olson, S. D. Clinical trials withstem/progenitor cells for tissue repair: let's not overlook some essential precautions［J］. Blood， 2007，109:3147-3151．

［4］ Wassmann, S., Werner, N., Czech, T., et al. Improvement of Endothelial Function by Systemic Transfusion of Vascular Progenitor Cells［J］. Circ Res，2006，99:E74-E83.