缺血后处理对兔脊髓缺血

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作者：高鹏，熊利泽，路志红，李万鹏，孟静茹

【关键词】 缺血后处理；脊髓缺血；再灌注损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶

【Abstract】 AIM: To investigate the impact of postischemic treatment on malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) during spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits. METHODS: Twentyfour male New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups (n=6 each)：control group, postischemic treatment for 15, 30 and 60 s groups (PA, PB and PC groups).Rabbits in the control group underwent the occlusion of abdominal aorta for 15 min followed by reperfusion for 1 h. In PA,PB and PC groups, rabbits underwent the 3 cycles of ischemia/reperfusion with the duration of 15 s/15 s, 30 s/30 s and 60 s/60 s respectively just after 15 min occlusion of the abdominal aorta. The MDA and SOD were measured at the 3 different time points：preischemia,10 min after ischemia and 1 h after reperfusion. RESULTS: At 1 h after reperfusion,the MDA concentrations in plasma and spinal cord homogenate in PA and PB groups were significantly lower than those in the control group (P<0.01), but in PC group they were significantly higher than those in the control group (P<0.01). The SOD activities in plasma and spinal cord homogenate in PA and PB groups were significantly higher than those in the control group (P<0.01), while in PC group they were both significantly lower than those in the control group (P<0.01). CONCLUSION: Early and shortterm (15 s/15 s and 30 s/30 s) ischemic postconditioning has an antioxidant potential, and depresses the production of oxygen free radicals and protects the spinal cord from ischemia/reperfusion injury.

【Keywords】 ischemic postconditioning; spinal cord ischemia; reperfusion injury; malondialdehyde; superoxide dismutase

【摘要】 目的： 通过在体兔脊髓缺血再灌注模型研究缺血后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤后体内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响. 方法： 雄性新西兰大白兔24只，随机分为4组，每组6只. 对照组仅行单纯缺血再灌注处理；缺血后处理15 s，30 s和60 s (PA，PB和PC)组分别于阻闭腹主动脉15 min后，再灌注15 s，30 s和60 s，缺血15 s，30 s和60 s，反复3次. 各组均在缺血前、缺血10 min和再灌注1 h时对所有动物抽动脉血并取脊髓组织匀浆后分别测定MDA含量和SOD活性. 结果： 再灌注1 h时血浆和脊髓组织中MDA含量：PA和PB组明显低于对照组（P<0.01），而PC组明显高于对照组（P<0.01）；SOD活性： PA和PB组明显高于对照组（P<0.01），PC组明显低于对照组（P<0.01）. 结论： 早期短时程缺血后处理（15 s/15 s和30 s/30 s）具有抗氧化作用，能够抑制再灌注后氧自由基的过量生成，对兔脊髓缺血再灌注损伤具有一定保护作用.

【关键词】 缺血后处理；脊髓缺血；再灌注损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶

截瘫是胸腹主动脉瘤手术后严重的并发症,术后截瘫的发生率约为6%～20%［1］. 寻找有效预防和治疗脊髓损伤的方法是目前研究的热点之一. 有学者陆续提出了缺氧后处理(hypoxic postconditioning) ［2］和缺血后处理(ischemia postconditioning) ［3］的概念. 我们在兔脊髓缺血模型上发现缺血后处理可以减轻脊髓缺血再灌注损伤，具有一定的脊髓保护作用，但其机制尚不清楚. 我们拟探讨缺血后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤后体内MDA 含量和SOD活性的影响，明确缺血后处理可能的机制.

1材料和方法

1.1材料雄性新西兰大白兔24只，体质量2.0~2.5 kg，由第四军医大学动物实验中心提供，随机分为4组，每组6只. 对照组行单纯肾下腹主动脉阻闭15 min再灌注1 h；缺血后处理A组(PA组)，行肾下腹主动脉阻闭15 min，再灌注前予缺血15 s /灌注15 s相同处理3次；缺血后处理B组(PB组)，行肾下腹主动脉阻闭15 min，再灌注前予缺血30 s /灌注30 s相同处理3次；缺血后处理C组(PC组)，行肾下腹主动脉阻闭15 min，再灌注前予缺血60 s /灌注60 s相同处理3次. PA， PB和PC三组动物均于末次缺血处理之后再灌注1 h.

1.2方法所有动物实验前晚禁食，不限制饮水. 实验当天予20 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）静脉麻醉. 术中持续输入复方乳酸钠4 mL/（kg・h）. 行股动脉穿刺，接压力传感器监测股动脉压，并从压力波形读取脉率（PR）. 自放入温度探头持续监测肛温，术中维持肛温于38~39℃. 选取缺血前、缺血10 min以及再灌注10 min时抽取动脉血样测定PaCO2, PaO2, pH及血糖.

脊髓缺血模型制作方法参照文献［4］以及本实验室以往所采用的方法［5］，取腹正中切口自剑突下两指剪开皮肤、腹膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，选取左肾动脉分支下1 cm处阻闭腹主动脉，阻闭15 min后恢复再灌注. 阻闭时，以股动脉压力波形消失，远端动脉压力监测值MAP≤10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）为准. 开放时以股动脉压力波形恢复为准.

所有动物分别于缺血前、缺血10 min和再灌注1 h时抽取动脉血测定血浆中MDA含量、SOD活性，于再灌注1 h时取新鲜脊髓组织匀浆后行MDA含量、SOD活性检测. 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，分光光度计采用美国Deckman公司制造DU800型核酸蛋白分析仪.

统计学处理： 所有生理学参数以及MDA含量和SOD活性以x±s表示，采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA），多组间两两比较采用LSD和SNK（StudentNewmanKeuls）检验. 统计软件采用SPSS12.0. P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1生理学指标脊髓缺血过程中血流动力学指标，直肠温度， pH, PaO2, PaCO2及血糖变化各组间均无明显差异（P>0.05）. 手术过程中，直肠温度保持在38~39℃. 肾下腹主动脉阻闭前后股动脉压力在各组间无显著差异（P>0.05，表1）.表1缺血后处理阻闭前后股动脉压变化（n=6, mmHg, x±s）

2.2MDA含量和SOD活性测定缺血前和缺血10 min时各组动物血浆中MDA含量和SOD活性比较无统计学差异（P>0.05，表2）. 再灌注1 h时，PA组和PB组血浆和脊髓组织中MDA含量显著低于对照组（P<0.01），SOD活性显著高于对照组（P<0.01），而PC组MDA含量显著高于对照组（P<0.01），SOD活性显著低于对照组（P<0.01，表3）.表2血浆中MDA含量及SOD活性（n=6, x±s）表3再灌注1 h脊髓组织MDA含量和SOD活性（n=6, x±s）

3讨论

本实验应用兔脊髓缺血模型发现，脊髓缺血15 min后，早期短时程缺血后处理（15 s/15 s和30 s/30 s）具有抗氧化作用，能够抑制再灌注后氧自由基的过量生成，可以减轻脊髓缺血再灌注损伤.

本研究所采用的兔脊髓缺血模型及观察指标是目前脊髓保护和机制研究中最常用的模型和指标［6-8］，行肾下腹主动脉阻闭后，远端动脉压力均维持MAP≤10 mmHg，证实此方法阻断确实，缺血效果可靠.

我们以往的研究［9］发现，缺血预处理与后处理有很大不同，预处理的保护作用按时间可以分为早期和延迟的保护作用，而后处理的保护作用一般是在早期的作用.

当氧自由基过剩时可使许多重要的生物大分子发生超氧化反应,细胞结构和功能的破坏, 表现为对细胞膜和细胞器膜等生物膜的攻击, 导致细胞水平上的广泛性损害及病理变化. 研究证实, 氧自由基在继发性脊髓损害中发挥重要作用, 它可使血管痉挛和闭塞, 造成脊髓缺血, 同时介导脂质过氧化反应, 导致膜破坏, 细胞死亡［10］. Lombardi 等［11］观察了兔脊髓缺血后再灌注期间的氧自由基含量及SOD活性变化, 发现缺血后即刻氧自由基含量升高, SOD活性下降. 提示在脊髓缺血再灌注损伤中, 氧自由基的参与是一重要的病理变化过程. 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基, 后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物, 如醛基、酮基、羟基、羧基以及新的氧自由基等，因而测试MDA的量可以反映机体内脂质过氧化的程度, 间接地反映出细胞损伤的程度. 氧自由基的毒性作用还可以导致线粒体超微结构和功能受损，使得原先位于线粒体内的某些与凋亡相关的活性物质如细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf1)释放入胞质，顺序激活下游胱天蛋白酶(caspase)，启动凋亡的瀑布级联反应［12］. SOD作为细胞内主要的抗氧化酶和自由基清除剂，其水平的降低，表明其保护组织细胞免受毒性氧自由基损伤的效能减弱. 缺血后处理可通过减少再灌注后氧自由基的过度生成并加速其清除，减轻氧自由基对生物膜结构和功能的破坏，阻断氧自由基凋亡途径，从而拮抗细胞凋亡的发生，发挥其保护作用［13］.

60 s/60 s缺血后处理加重了脊髓的氧化损伤，这可能是由于当缺血再灌注损伤发展到一定程度以后，氧自由基的生成大大超过了清除，细胞逐渐由凋亡变为坏死，缺血后处理已经不可能对凋亡的细胞进行逆转，因此脊髓的损伤逐渐加重.

总之，早期短时程缺血后处理（如15 s/15 s和30 s/30 s）具有抗氧化作用，能够抑制再灌注后氧自由基的过量生成，对脊髓的缺血再灌注损伤具有保护作用.

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［12］ Finkel E. The mitochondrion: Is it central to apoptosis［J］. Science, 2001,292(5517):624-626.

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