胆微透析技术及其在药学研究中的应用
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摘 要：目的：介绍胆微透析技术及其在药学研究中的应用。方法：检索、阅读近年来国内外的相关文献，并进行分析、归纳。结果：综述了胆微透析技术的基本原理、特点及影响因素，并重点介绍了其在肠肝循环药物以及经胆囊排泄药物的药动学研究中的应用。结论：胆微透析技术在药学研究中具有不可替代的作用, 但仍有不足之处，尚需继续研究不断改进完善。
关键词：胆微透析；药学；胆；肠肝循环
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0035-04
Microdialysis in Bile and its Application on Pharmaceutical Research
MAO Zeling,FENG Jian,LI Fanzhu
(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)
Abstract:Objective：To introduce the bile microdialysis technique and its application in pharmaceutical research.Method：The literature at home and abroad in recent years were analyzed and summarized. Results：Bile microdialysis technique reviewed the basic principles, characteristics and influencing factors, and highlighted the application in the pharmacokinetics of drugs in the enterohepatic circulation and excreted by the gallbladder. Conclusion：Bile microdialysis technique in pharmaceutical research plays an irreplaceable role, but there are still shortcomings, which need to study and improve constantly.
Key words:microdialysis;Pharmaceutic;bile;enterohepatic circulation
胆微透析技术能直接、有效地对胆汁中的药物及其代谢产物浓度进行持续检测，是药物动力学研究的重要工具，具有不可替代的作用及广阔的应用前景。本文就胆微透析技术的基本原理、特点及影响因素作一综述，并重点介绍其在具有肠肝循环或经胆囊排泄药物的药物动力学研究中的应用。
1 胆微透析技术的原理和特点
胆微透析技术以透析原理作为取样基础，透析探针为半密闭系统，由大小两个导管组成，各有一入口和出口。用于引流胆汁的大导管可植入一只成年大鼠的胆管中，小导管即灌流液导管则由一根悬挂在大导管中的线性探针构成。通过灌流泵以一定流速推动灌流液由入口进入探针中，胆汁中的低分子量物质随浓度梯度经透析膜连续不断进入灌流液导管内，从而达到从活体组织中取样的目的[1-6]。通过胆微透析收集得到的透析液可直接用于检测分析而不影响机体胆汁流量和无胆汁丢失。胆微透析也可较长时间用于清醒的、自由活动的动物[7]。胆微透析探针的示意图见图1。
透析膜对于分子大小有一定限制，唯有较小分子量的物质才能通过半透膜，因此，胆微透析采样所得到的样品为非蛋白结合态的小分子物质，结合态的物质则因分子过大无法通过半透膜，而不能被收集检测[1-2]。肝脏分泌进入胆汁的化合物通常为分子量超过300～400 g/mol的极性分子，而实际分子量的界限取决于物种，大鼠是325 g/mol，人体是500 g/mol。分子在肝脏经过生物转化形成的代谢产物可增加母体化合物的分子量和极性，形成的轭合物更容易被检测到。
胆瘘引流术是目前动态连续研究胆汁中物质的最常用的取胆汁样本的方法。与这种传统方法相比，胆微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样,特别适用于研究生命过程的动态变化。另一大优点是样品的采集与分析过程既可离线也可在线检测，它与HPLC及CE等微量及超微量分离、分析技术相结合,具有非常高的检测灵敏度和选择性[8-11]。
2 胆微透析技术的影响因素
2.1 胆汁组分
了解胆汁成分是如何影响透析液丢失和药物跨透析膜转运是非常重要的。灌流液经膜丢失可能会大大减少所收集的透析液量。在线研究时，液体流速的变化可能引起进样量的变化，从而影响透析物的定量以及探针回收率的校正。在灌流液中加入胶体右旋糖酐-70可平衡在这些组织中的液体在探针膜两侧间的流动[12]。
2.2 超滤和渗透差
在透析过程中，超滤和渗透流量都能引起灌流液的流失。超滤是因压力差而发生的液体的跨膜流动。膜两侧的非扩散性颗粒浓度的差异引起的水分的跨膜转运即为渗透流量。以Ringer’s液作为灌流液用于大鼠胆微透析，就会发生渗透流量致使水分流向探针膜外，引起所收集的透析液量大为减少。而在Ringer’s液中加入浓度约为2%的胆盐，则足以阻止水分的丢失，维持正常流速。
2.3 灌流液组分
探针中灌流液组分可明显影响胆透析液的收集量。由于小分子离子能够自由穿过透析膜，迅速形成膜两侧离子浓度的平衡，因此，以去离子水作为灌流液透析1 M 氯化钠溶液或林格氏液时，透析液量无显著改变。但是当胆汁引流管中是浓度为10mM的十二烷基硫酸钠或者胆盐林格氏液时，收集到的样品量就有显著减少。
胆盐和十二烷基硫酸钠是疏水性大分子物质，两者均不易通过透析膜，但如果仅以分子量而言，有少数的胆盐和十二烷基硫酸钠分子还是可以通过膜进入透析管从而降低膜两侧的渗透压差。在大鼠的胆汁中，胆汁酸普遍以混合微胶粒的大聚合物形式存在，临界胶粒浓度的范围是5～15 mM，混合微胶粒大约包含500个胆汁酸分子，分子量27000道尔顿左右[13]。与胆汁酸分子相比较，微胶粒的形成会降低胆汁的总渗透压，但是由于这些大聚集物完全无法透过探针膜，其产生的渗透压差就会驱动水从探针膜内流出。尤其当胆盐的浓度超过临界胶粒浓度时，收集到的透析液量急剧下降。
2.4 流速及维护
流速的测量均在室温下进行，一般灌流速度在1～20μL/min左右。
收集液前要求探针先透析平衡30min。每次透析实验后用去离子水冲洗探针，同时检测探针的完整性。在无探针的导管中，以1 μL/min的速度灌流60 min以检测推助器的流速。
3 胆微透析探针回收率的测定方法
由于胆微透析采样主要是利用探针上透析膜的扩散作用进行药物的采样，所得到的是部分未结合型药物并非探针外组织外液的药物总浓度，因此必须测定微透析探针采样的体外回收率，用以计算组织外液的实际药物浓度。
胆汁微透析探针回收率的测定方法为：针筒内装含有药物的林格氏液，此部分药物浓度称为Cs,利用灌流泵设定流速为20或40μL/min模拟胆汁流入探针的状态，然后胆汁探针的部分利用林格氏液做灌流液。利用微透析注射针帮助灌流液以流速2.6μL/min推入微透析探针，接着每10min收集透析液样品至达成平衡，此部分药物浓度称为Cdial[14]。
计算体外回收率的公式：回收率=（Cdial/Cs）×100
4 胆微透析技术的应用
将胆微透析探针植入胆管中可用于监测正常无损伤动物胆汁中的药物浓度[7]。药物经过肝脏代谢后，会经胆汁排出体外，经胆汁排泄药物包括原型药与其代谢物。进行胆汁药物测定除可了解药物胆汁排泄的情况，还可研究药物的肠肝循环。微透析应用于胆汁中药物动力学的研究，是将一个胆分流探针置入大白鼠的胆管，胆汁进入探针后会被分流回肠道中，不会造成胆汁的流失，亦不会影响胆汁正常排泌，可用于长时、持续的收集检测排泄于胆汁中的未结合型的原型药物与其代谢物[15，20]。
4.1 经胆囊排泄药物药物动力学研究
4.1.1 通过联用液相色谱法与在线微透析技术 测定大鼠胆汁中非结合型的头孢吡肟药代动力学 将一个微透析探针插入位于肝脏和十二指肠之间的总胆管中，接着静脉注射头孢吡肟，按50 mg/kg给药，将头孢吡肟从透析液中分离并进行定量测定。通过使用一个全多孔型硅胶硅烷化键合固定的反相碳18柱（250m×4.6mm，5mm)，维持室温不变[16]。样品用流动相进行洗脱，流动相是浓度为100 mM、pH 为3.0的磷酸二氢钠与甲醇的混合液，比例是87∶13，紫外分光光度检测器的波长选择270 nm，结果表明头孢吡肟在胆汁中的消除半衰期是64.01+/-9.32 min[17-19]。该研究也是药物在胆汁排泄中微透析技术应用的一个典型例子。
4.1.2 氯霉素与其葡糖苷酸衍生物经胆汁排泄的微透析研究通过使用微透析探针结合自动的在线微孔高效液相色谱法，评估氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的胆汁排泄。将微透析探针插入位于肝脏和十二指肠之间的胆管中，静脉注射琥珀酸钠氯霉素，按100mg/kg给药后，收集并测定胆汁透析液中非结合型的氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的量。药物动力学研究结果显示氯霉素的在胆汁中的处置过程符合二室模型，然而氯霉素葡糖苷酸衍生物的处置过程符合单室模型。测得胆管中氯霉素葡糖苷酸衍生物的浓度-时间曲线下面积是氯霉素的两倍，氯霉素葡糖苷酸衍生物胆汁排泄的清除率明显高于氯霉素，表明氯霉素葡糖苷酸衍生物被更多排泄进入胆汁中[21]。
4.1.3 小檗碱经肝胆管排泄的药动学研究小檗碱是从具有芒刺的小檗属或黄连的根及树皮分离出来的具有生物活性的成分。联用了体内微透析技术和高效液相色谱法对小檗碱药代动力学和肝胆管排泄的机制进行了研究。对照组大鼠仅仅给药小檗碱，而药物治疗组在给予小檗碱10 min前，先注入P-糖蛋白抑制剂黄孢霉素A，有机阳离子的传送器和P-糖蛋白抑制剂奎尼丁，细胞色素P450抑制剂SKF-525A（普罗地芬）以及葡萄苷酸化抑制剂丙磺舒。结果表明在剂量范围10~20 mg/kg时，小檗碱呈现出线性药代动力学现象，浓度-时间曲线下面积也随着剂量的增大成比例的增加[22]。此外，小檗碱经肝胆管排泄所需的浓度梯度，是以小檗碱在胆汁和血液中的分配比为根据；由于同剂量给予小檗碱和黄孢霉素A或者奎尼丁10 mg/kg，小檗碱的活性成分可能会受P-糖蛋白和有机阳离子的传送器的影响，胆汁中小檗碱的含量明显下降了。此外，通过液相色谱法和光谱测定法鉴定，小檗碱是在肝脏中进行代谢的，分别是I相的脱甲基作用和II相的葡萄苷酸化作用。当给予治疗组SKF-525A时，小檗碱部分的第I相代谢反应下降了，但是小檗碱的第II相反应-葡萄苷酸化作用不受丙磺舒的明显影响[23]。
4.1.4 通过在线微透析技术联用微内径液相层析的荧光检测，测定大鼠胆汁中的非结合型20(S)-喜树碱将线性胆汁探针埋植于肝脏和十二指肠之间的胆管处，透析液则连接至带有荧光检测功能的高性能微孔液相层析柱上。样品用流动相洗脱，流动相是甲醇与浓度为100 mM的磷酸二氢钠的混合液，比例是35∶65，用磷酸调溶液的pH至2.5[24]。喜树碱的定量限是1 ng/mL，接着静脉注射5 mg/kg喜树碱。
4.2 肠肝循环药物药动学研究
4.2.1 通过使用肝十二指肠微透析探针，研究氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的肠肝循环该实验以肝十二指肠探针，将药物治疗组供体大鼠的胆汁通过胆插管与非治疗组受体大鼠的十二指肠相连接，用以评价氯霉素在药代动力学中的应用-肝代谢作用和肠肝循环。非结合型的氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的血药浓度是通过联用在线微透析技术和微孔液相色谱法测定的。结果表明在供体大鼠和受体大鼠的血液中，均能检测到氯霉素及其葡糖苷酸衍生物，接着对供体大鼠静脉注射琥珀酸钠氯霉素，按100 mg/kg剂量给药。研究发现，虽然肠肝循环仅为一个小范围（约1.8%）[25]，但也参与了非结合型氯霉素的处置过程，在线微透析技术对于该研究是适用的。
4.2.2 通过使用胆微透析探针，研究胆汁盐对咖啡因与酚酞葡糖苷酸重吸收的影响 通过咖啡因与酚酞葡糖苷酸两种分析物进行对比，表明胆盐可通过微透析探针影响分析物的重吸收，胆盐可与酚酞葡糖苷酸相互作用，但不能与咖啡因相互作用。结果还表明当把胆盐考虑在内时，体外探针的校准可以用来计算体内分析物在胆汁中的浓度，通过体外回收萃取效率校正的体内酚酞葡糖苷酸透析液浓度与体内胆汁中测得的浓度一致。
酚酞葡糖苷酸是一个典型的已知经肠肝循环的葡糖苷酸缩合物，当给与酚酞时，可被快速、广泛的代谢为酚酞葡糖苷酸并经胆汁分泌。一旦到达肠腔，酚酞葡糖苷酸被水解，酚酞可重吸收进入门脉循环。酚酞是在肝脏中生物转化为高分子量的典型化合物，然后再经历肠肝循环。酚酞-酚酞葡糖苷酸已作为肝功能和肠肝循环研究的模型化合物，具有转移和完整胆汁流量的麻醉大鼠的体内酚酞葡糖苷酸以用于微透析取样。
结果表明用胆微透析探针，咖啡因的提取效率比酚酞葡糖苷酸高，与浓度无关，也不受胆盐的影响。而酚酞葡糖苷酸可与胆盐相互作用，在胆盐中的提取效率比在林格氏液中更低。当灌注液中胆盐成分与探针所在基质的成分相近时，萃取效率与回收率相等。体外回收实验表明，酚酞葡糖苷酸在BSR中的浓度范围0.1～10 mM时，体外提取效率与浓度无关，重现性好，因此适用于分析体内试验数据。另外，用体外萃取效率校正的透析液酚酞葡糖苷酸的浓度与直接测得的胆汁样品浓度吻合。
5 结 语
胆微透析技术是微透析技术的一种，是一门新兴的、用途广泛的技术，是将一种具有透析作用且充满液体的微细探针置于胆管内, 与探针周围组织进行物质交换后测定其内的化学物质含量的技术。胆微透析具有定量、定位、微分析、连续取样、动态分析的特点，为胆管给药的药效和药代动力学研究提供可靠和全新的手段，这无疑是方法学上质的突破。胆微透析技术有很多优点，同时也有不足之处，对胆微透析探针的校正和对微量样品分析方法的要求是仍需要继续研究的问题。
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