红花水煎液对博莱霉素诱导的硬皮病小鼠肺组织胶原含量的影响
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【摘 要】目的：观察红花水煎液对博莱霉素诱导的硬皮病小鼠肺组织的HE和MASSON染色病理变化及MASSON染色胶原含量分布变化，探讨红花对硬皮病肺纤维化的影响。方法：将32只BALB/C小鼠随机分为4组：空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花组，每组8只。除空白对照组外，各组建立硬皮病小鼠模型。醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松混悬液0.2 mL灌胃，红花组予红花水煎液0.2 mL灌胃，空白对照组和模型对照组予同体积生理盐水灌胃。采用HE和MASSON染色观察各组小鼠肺的病理改变，使用IPP 6.0图像分析软件测定MASSON染色胶原含量分布变化，SPSS 17.0软件进行统计分析。结果：与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织胶原含量显著升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花组小鼠肺组织胶原含量明显降低（P < 0.05）；醋酸泼尼松组与红花组胶原含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：红花能够有效降低博莱霉素诱导的硬皮病小鼠肺组织胶原含量，具有抗硬皮病肺纤维化的作用。
【关键词】 硬皮病；肺纤维化；红花水煎液；胶原含量；博莱霉素；小鼠
【ABSTRACT】Objective：To probe the effects of safflower decoction on pulmonary fibrosis by observing the staining pathological changes of HE and MASSON and the distribution of MASSON staining collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma.Methods：Thirty-two BALB/C mice were randomly divided into 4 groups：a blank control group，a model control group，a prednisone group and a safflower group，8 rats in each.Except for the blank control group，mouse models with scleroderma were established in other groups.Rice in the Prednisone group were given intragastric administration with 0.2 mL prednisone suspension，while those in the safflower group were given safflower decoction in the same way.Mice in the blank control group and the model control group were also given intragastric administration with saline of he same volume.HE and MASSON stainings were used to observe the pathological changes of lung in each group.IPP6.0 image analysis software was used to determine the distribution of MASSON staining collagen content，and SPSS17.0 software was used for statistical analysis.Results：Compared with the blank control group，the collagen content in lung tissue of mice in the model control group significantly increased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the collagen content in lung tissue of mice in the prednisone group and the safflower group significantly decreased （P < 0.05）.The difference of collagen content between the prednisone group and the safflower group was not statistically significant（P > 0.05）.Conclusion：Safflower can effectively reduce the lung collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma，with a function of against pulmonary fibrosis.
【Keywords】 scleroderma；pulmonary fibrosis；safflower decoction；lung；collagen content；bleomycin；mice
硬皮病（scleroderma）是一种原因不明，临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，也可累及内脏（肺、心、消化道等器官）的结缔组织疾病。其发病机制核心为成纤维细胞合成过多的胶原，导致皮肤和内脏的纤维化。国内外文献报道，博莱霉素诱导的硬皮病小鼠模型与临床硬皮病患者组织病理改变和免疫组化变化极为相似，适用于对硬皮病皮肤和肺纤维化及血管病变的研究[1-3]。本实验在博莱霉素诱导的小鼠硬皮病模型下用红花水煎液干预治疗，探讨红花治疗硬皮病肺纤维化的
作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 BALB/C小鼠32只，雌性，6～8周，SPF级，体质量18～22 g，来自广西医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK（桂）2014-0002，实验动物使用许可证号SYXK（桂）2014-0003。
1.2 实验药品、试剂与仪器 注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，生产批号440392）；醋酸泼尼松片（广东华南药业集团有限公司，生产批号150301）；红花（南宁生源中药饮片有限责任公司，生产批号140901）。以上药品均来自广西医科大学第一附属医院药房。HE染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号20160106，产品序号D006）；Masson染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号20160106，产品序号D026）；OLYMPUS正置荧光显微镜（日本OLYMPUS，规格型号BX53）。
1.3 给药剂量 根据人体与动物药物等效剂量换算方法，醋酸泼尼松用量为0.09 mg・d-1，红花用量为30 mg・d-1。
1.4 药品制备 博莱霉素溶于高压灭菌后的pH = 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备成质量分数为200 μg・mL-1的博来霉素磷酸盐缓冲液保存备用。醋酸泼尼松片用蒸馏水溶解配成0.45 mg・mL-1混悬液备用。红花采用常规方法煎煮成质量分数为0.15 g・mL-1的红花水煎液保存备用。
2 方 法
2.1 动物分组和处理 将32只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花组，每组8只。按照参考文献[1-3]方法剃除小鼠背部被毛约1.5 cm×1.5 cm，适应性喂养2 d后开始实验。空白对照组用PBS 0.1 mL皮下注射，模型对照组、醋酸泼尼松组和红花组予博莱霉素磷酸盐缓冲液0.1 mL背部皮下注射，4组均为每日1次，连续注射28 d。造模同时即行药物干预，空白对照组和模型对照组予生理盐水0.2 mL灌胃，醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松混悬液0.2 mL（含醋酸泼尼松0.09 mg）灌胃，红花组予红花水煎液0.2 mL（含红花30 mg）灌胃，各组小鼠均每日灌胃1次，共28 d。实验结束后，禁食12 h，水合氯醛腹腔注射处死小鼠，取左肺置于甲醛中固定，制成石蜡切片。
2.2 病理学检查 小鼠肺组织石蜡切片经HE和MASSON染色后进行病理检查，分析各组之间肺组织病理形态学改变。
2.3 肺纤维化评分 根据HE染色病理形态学变化，参照Szapiel等[4]的方法，将肺纤维化分级及评分如下：（-），评0分，无明显炎症改变，极少炎性细胞浸润，极少成纤维细胞生成；无胶原纤维生成。（+），评1分，轻度炎症改变，较少量炎性细胞浸润，较少成纤维细胞增生；较少胶原纤维生成，病变范围小于组织的20%。（++），评2分，中度炎症改变，较多成纤维细胞增生；较多胶原纤维生成，受累面积占组织的20%～50%。（+++），评3分，重度炎症，大量成纤维细胞增生；大量胶原纤维生成，面积 > 50%。
2.4 MASSON染色肺组织胶原定量 每张切片选取6个不重复的阳性视野（×200倍），MASSON染色以蓝色胶原沉积为阳性信号。用IPP 6.0图像分析软件分析，进行灰度变换，使蓝色阳性面与背景分开，进行胶原定量分析，计算肺组织胶原沉积面积与视野内肺组织总面积的比值，并取平均值。
2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，方差齐性检验后采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK（方差齐）或Games-Howell（方差不齐）检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组小鼠一般情况比较 实验过程中各组均无死亡。空白对照组小鼠精神状态佳，进食、进水正常，活动灵敏度强，攻击性强，体质量未见明显减轻，背部毛发光泽发亮，再生较快，背部皮肤柔软，易被提起。与空白对照组比较，模型对照组小鼠精神较差，进食、进水减少，活动灵敏度降低，攻击性降低，体质量略减轻，背部毛发极少或完全不生，背部皮肤增厚，坚实发紧，不易捏起；醋酸泼尼松组和红花组小鼠精神一般，体质量稍减轻，行为灵敏度下降，攻击性降低，背部毛发有不同程度再生，再生速度慢，皮肤有紧绷感，未感明显增厚，不易被提起。醋酸泼尼松组和红花组小鼠一般情况差异不明显，但2组小鼠身体状况明显好于模型对照组。
3.2 各组小鼠肺组织HE和MASSON染色病理变化比较 肉眼观察空白对照组小鼠肺呈粉红色，形态正常，弹性好，HE和MASSON染色后镜下观察肺组织结构清晰完整，未见炎症细胞浸润和胶原沉积。肉眼观察模型对照组小鼠肺为灰白色或苍白色，体积缩小，硬度增加，弹性较差，镜下可见肺泡间隔增宽，肺泡破坏、融合明显，炎症细胞大量浸润，MASSON染色可见蓝色的胶原纤维数量明显增多。肉眼下醋酸泼尼松组和红花组小鼠肺颜色暗淡，肺肿胀，体积增大，弹性一般，镜下可见部分肺泡间隔增宽，部分肺泡破坏、融合，少量炎症细胞浸润，蓝色胶原纤维较多；但与模型对照组比较，2组小鼠肺组织纤维化程度明显减轻。见图1、图2。
3.3 各组小鼠肺纤维化程度评分比较 空白对照组小鼠肺组织结构正常，无炎症细胞浸润，肺泡间隔无明显增宽，未见炎症和纤维化表现。模型对照组肺泡壁厚度明显增加，肺泡结构破坏甚至消失，肺泡间隔纤维化显著。醋酸泼尼松组和红花组虽然也有纤维化表现，但较模型对照组明显减轻。与空白对照组比较，模型对照组纤维化评分明显增高（P < 0.05）。醋酸泼尼松组和红花组纤维化评分明显高于空白对照组（P < 0.05），但显著低于模型对照组（P < 0.05）。醋酸泼尼松组和红花组纤维化评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
3.4 各组小鼠肺组织胶原含量比较 与空白对照组比较，模型对照组、醋酸泼尼松组及红花组胶原含量明显增加（P < 0.05）；与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花组胶原含量显著降低（P < 0.05）。
醋酸泼尼松组和红花组胶原含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。
4 讨 论
硬皮病是一种以皮肤和内脏器官进行性纤维化的全身性疾病，涉及皮肤、关节、肌肉、肺、心脏等多个部位的损害。硬皮病中肺纤维化的发生率仅次于皮肤、外周血管及食管，肺纤维化早期多没有症状，直到硬皮病晚期，肺的损害可以成为患者死亡原因。糖皮质激素是目前临床上治疗硬皮病最具性价比的药物，对硬皮病所致关节炎、肌炎、心包炎、心肌损害、肺间质病变的炎症期有一定疗效[5]，但其副作用亦明显。由于肺纤维化治疗难度大，预后差，因此加强对硬皮病肺纤维化的研究，缓解和控制其进行性发展，具有重要的现实和社会意义。
肺纤维化的病理特点是肺泡上皮的损伤，胶原纤维的合成增加，细胞外基质（ECM）的沉积。细胞因子[如转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素等]、氧化应激（OS）、热休克蛋白47（HSP47）等可引起肺组织炎症和胶原过度表达，ECM沉积，最终形成肺纤维化，影响肺功能[6]。
红花是一种经典的活血化瘀中药，具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[7-8]。Wang等[9]发现，在博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，红花黄色素（SY）显著降低肺组织中羟脯氨酸含量，降低TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白的表达，抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，最后达到抗肺纤维化的效果。张亚丹等[10]以TGF-β1诱导NIH/3T3细胞为模型，发现羟基红花黄色素A（HSYA）可抑制TGF-β1诱导NIH/3T3细胞与肺纤维化相关的信号转导，进而缓解肺纤维化。临床研究表明，红花亦对肺纤维化具有一定的防治作用。赵青文等[11]运用红花治疗特发性肺纤维化患者19例，所有患者经红花治疗后临床自觉症状、肺功能及动脉血气分析结果均有不同程度改善，9例可以进行正常的生活工作，6例可以进行一般日常活动，4例能进行少量室内活动。宋远瑛等[12]将48例特发性肺纤维化患者分为治疗组和对照组，每组24例，对照组使用醋酸泼尼松治疗，治疗组与对照组的基础上加用红花治疗，结果显示，2组患者经治疗后呼吸疾病问卷（圣乔治评分）、动脉血气分析及肺功能均有所改善，治疗组效果较对照组更显著（P < 0.05）。本动物实验通过光镜下肺组织病理观察可看到，模型对照组肺组织炎症细胞广泛浸润，肺泡间隔明显增宽，肺泡结构破坏严重，胶原纤维增生明显，提示小鼠硬皮病模型复制成功。醋酸泼尼松组与红花组炎症细胞浸润较轻，肺泡结构部分破坏，可见纤维化程度较轻，2组纤维化程度差异不明显。通过胶原含量分析可得出，模型对照组小鼠胶原含量显著高于空白对照组（P < 0.05）；而醋酸泼尼松组、红花组与空白对照组比较，胶原含量虽有升高，但较模型对照组低，说明2组肺部纤维化程度轻。但2组作用效果比较差异比较无统计学意义（P > 0.05），说明红花水煎液能有效对抗硬皮病小鼠肺纤维化。以上表明红花无论在临床研究或是动物实验中对肺纤维化的形成均有一定的拮抗作用，但是其抗硬皮病肺纤维化的机制还有待进一步明确。
5 参考文献
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[12] 宋远瑛，李树岗.红花黄色素对于特发性肺纤维化患者生活质量改善的临床研究[J].中国药物经济学，2013，8（7）：72-73.
收稿日期：2016-04-18；修回日期：2016-05-30