纤维素酶诱变和产酶的改进
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇纤维素酶诱变和产酶的改进范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
本文作者：宋鹏 李爱江 单位：河南科技大学农学院 河南科技大学食品与生物工程学院
植物纤维素是是自然界中最丰富的可再生资源。借助纤维素酶的水解作用，将纤维素转化为可直接利用的资源与能源，可以缓解能源危机以及化石能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用。目前，纤维素酶在食品发酵、生物饲料、工业洗涤等各个领域也都有一定程度的应用。由于细菌产纤维素酶有着生长迅速、容易培养、不产生孢子等优点，其应用范围不断扩大，需求量不断提高，高效产酶菌种的分离筛选和诱变育种显得极其重要[1-3]。本研究以一株产纤维素酶枯草芽孢杆菌BacillussubtilisHAS-8为出发菌株，通过He-Ne激光诱变，选育产酶能力更强、生长更迅速的菌株，并优化其发酵条件，以期扩大纤维素降解菌种的范围，为纤维素发酵生产提供优良菌株。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种从洛阳国家牡丹园土壤中筛选得到一株枯草芽孢杆菌BacillussubtilisHAS-8，其刚果红纤维素酶筛选平板透明圈HC值为1.6，纤维素酶活力为385.97U/mL。1.1.2培养基种子培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，pH7.0，水1000mL；筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO47H2O0.2g，葡萄糖2.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，水1000mL，pH7.0；纤维素酶发酵培养基：麸皮10.0g，玉米粉10.0g，牛肉膏1.0g，蛋白胨2.0g，NaCl1.0g，KH2PO41.0g，K2HPO41.0g，MgSO47H2O0.5g，水1000mL，pH7.0。
1.2方法
1.2.1He-Ne激光诱变以1%的接种量将菌株接种于种子培养基中，30℃培养20h。取10mL，3000r/min离心20min，弃去上清液，将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤，重复洗涤两次。最后将得到的菌悬液放入无菌生理盐水中，控制菌体浓度约108CFU/mL。选择激光器的输出功率为15mW，将0.5mL菌悬液置于已灭菌的试管中，并使其位于激光器的正下方30cm处，照射20min[4-6]。诱变结束后，根据筛选培养基平板上的透明圈与菌株直径的比值（HC值），选择HC值大于1.6的正突变菌株。
1.2.2正突变菌株的酶活力测定及遗传稳定性分析将从纤维素酶筛选培养基平板上挑选5株HC值最大的正突变菌株测定其纤维素酶活力，筛选出性能最优的目标菌株。将最终获得的正突变菌株在斜面培养基上连续传代30次，每5代接入酶发酵培养基中测定纤维素酶活力，分析其遗传稳定性。
1.2.3发酵条件正交试验设计目标菌株在种子培养基中30℃培养10h，接种量3%接入装有80mL发酵培养基250mL的三角瓶中，培养温度30℃，摇床180r/min进行培养。以麸皮、玉米粉、培养时间、起始pH为4种因素，各选取3个水平，以发酵液中的活菌数为指标，采用L9(34)正交表，利用SPSS软件设计正交试验，试验重复两次，且重复采用随机区组设计，进行方差分析和单因素统计[7-9]，如表1所示。
1.2.4纤维素酶活力测定采用DNS法测定纤维素酶活力。50℃条件下，每分钟每毫升酶液水解底物羧甲基纤维素钠产生1μg葡萄糖所需的酶量为1个单位。
2结果与分析
2.1正突变菌株的HC值及酶活力测定根据透明圈HC值和生长速度，从正突变菌株中挑选出5株细菌，编号保存，并转入纤维素酶发酵培养基中，测其发酵液纤维素酶活力，结果见表2。由表2可见，经过诱变后的正突变菌株，其HC值和纤维素酶活力明显提高。其中菌株HAS-8D的HC值及酶活力提高的最为明显，酶活力经过诱变后提高了68.2%。同时它在斜面培养基生长迅速，菌落较大，因此选择菌株HAS-8D为目标菌株，进行下一步研究。
2.2突变菌株的遗传稳定性分析经过菌株的传代培养，每隔5代测定其纤维素酶活力，观察菌株HAS-8D的遗传稳定性，结果见图1。经过ANOVA分析，p=0.872，p>0.05，说明各代的酶活力无显著性差异，正突变菌株HAS-8D具有良好的遗传稳定性。
2.3发酵条件优化碳源麸皮、氮源玉米粉、培养时间和起始pH对发酵液菌数影响的正交试验结果如表3、表4和表5所示。由表4可以看出，碳源麸皮、氮源玉米粉和起始pH的p<0.01，差异极显著；培养时间的p<0.05，差异显著。F检验结果表明，麸皮、玉米粉、培养时间以及起始pH对发酵液菌数的影响达显著水平。由表5可以分析得到各因素水平的优劣顺序是：A3>A2>A1，B2>B3>B1，C2>C1>C3，D2>D1>D3。最后得出最佳的组合是A3B2C2D2，即为麸皮2.0%、玉米粉1.0%，培养时间24h，起始pH为7.0。按照正交试验设计的培养条件进行发酵培养，菌株HAS-8D发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL，酶活力为684.35U/mL。
3结论与讨论
本研究选择一株具有较高纤维素酶活力的枯草芽孢杆菌菌株为出发菌株进行激光诱变。通过He-Ne激光照射后，从纤维素酶筛选培养基平板上分离出5株HC值高的正突变菌株，其中菌株HAS-8D的HC值及酶活力提高的最为明显，酶活力经过诱变后提高了68.2%。经过30代传代培养，菌株具有良好的遗传稳定性。利用SPSS软件设计正交试验，最终得到菌株HAS-8D的最佳发酵条件为麸皮2.0%、玉米粉1.0%，培养时间24h，起始pH为7.0。按照优化后的条件进行发酵培养，发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL，酶活力为684.35U/mL。与同类产纤维素酶的芽孢杆菌相比，菌株HAS-8D的纤维素酶活力高，对纤维素有良好的降解能力，具有相当广阔的应用前景。He-Ne激光诱变是一种高效的物理诱变技术，已被广泛应用到生物学各领域中。它具有能量密度高、靶点小、方向性好、诱变当代即可出现遗传性突变等特点，操作简单，使用安全，近年来应用于微生物育种中取得许多进展，也分离筛选出许多性能提高的菌株[10-12]。但经过传现，选育出来的菌株遗传稳定性较差，往往一两代就发生回复突变，产量降低，没有良好的稳定性和延续性，无法大规模产业化。本研究选育出来的菌株HAS-8D经过30代培养，酶活力稳定，为其应用提供了保证。