RP―HPLC法测定荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及茶多酚的含量
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摘要：建立了反相高效液相色谱（rp-hplc）测定荟酚杀菌防腐剂中有效成分芦荟苷、茶多酚的含量测定的方法。采用ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相分别为乙腈-水、0.1%磷酸水溶液-甲醇，流速为0.70 mL/min、检测波长分别为355、279 nm，柱温35 ℃。结果表明，芦荟苷在0.044～0.264 mg/mL（r=0.999 2）、茶多酚在0.081 6～2.937 6 mg/mL（r=0.999 1）范围内，其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系；芦荟苷的平均加样回收率为98.25%，相对标准偏差RSD为2.07%、茶多酚的平均加样回收率为100.31%，相对标准偏差RSD为1.42%（n=5），3个不同批次的荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷、茶多酚的平均含量分别为0.095、0.090 mg/mL。该方法操作简便、准确度高、重现性好，可作为荟酚杀菌防腐剂中有效成分芦荟苷及茶多酚的含量测定方法。
关键词：荟酚杀菌防腐剂；芦荟苷；茶多酚；反相高效液相色谱
中图分类号：S482.2+94 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）14-3737-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.14.050
Abstract： A reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC） method for determination of the content of effective components of aloin and tea polyphenols in the Hui Fen preservatives. The chromatographic conditions were as follow： ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） was used， the mobile phase was acetonitrile water，0.1% phosphoric acid-methanol and the flow rate was 0.70 mL/min， at the detection wavelength of 294 nm，and the column temperature was 35 centigrade. The results showed that there was a good linear relationship between the concentration and peak area of aloin and tea polyphenols in the range of 0.044～0.264 mg/mL（r=0.999 2） and 0.081 6～2.937 6 mg/mL（r=0.999 1）. The average recoveries of aloin was 98.25%，relative standard deviation（RSD） was 2.07% and the average recovery rate of Tea polyphenols was 100.31%，relative standard deviation（RSD） was 1.42%（n=5）. The average content of 5 different batches of aloin in AI Jie preservatives was 0.095 mg/mL，the tea polyphenols was 0.090 mg/mL. The method is simple， accurate and reproducible， can be used to control the content of active ingredient of aloin and tea polyphenol in Hui Fen preservatives.
Key words： Hui Fen preservatives； aloin； tea polyphenols； RP-HPLC
荟酚杀菌防腐剂是由湖北省药用植物研发中心研发的一种微乳剂，主要用于由纯天然植物制成的洗脸扑的杀菌及防腐。该制剂加入植物中兼具抑菌与美容作用的有效成分，既能抑制洗脸扑中细菌的生长，还能起到美容的作用。其中最主要的有效成分为芦荟提取物中的芦荟苷及绿茶提取物中的茶多酚。芦荟苷能保护和营养皮肤、除皱祛斑、恢复细胞活力、促进细胞再生、延缓皮肤衰老，有十分明显的美容作用[1]。芦荟苷属于蒽醌类成分，具有杀菌、抑菌、消炎、解毒、促进伤口愈合等作用，芦荟的杀菌、消炎作用能有效地消除粉刺、痤疮[2]。茶多酚因具有优异的抗菌、抗氧化、抗癌等作用已被广泛的用于食品、医疗、日用化工等多方面[3]。茶多酚具有广谱的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、部分霉菌等具有明显的抑制作用[4]。茶多酚还是一种理想的天然抗氧化剂，具有延缓衰老和抵抗紫外线辐射等多种功效[5]。本研究利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对复方制剂中芦荟苷及茶多酚的含量进行测定，为建立该制剂的质量检测标准提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
DIONEXUltimate 3000分析型液相色谱仪（戴安中国有限公司），Starsorius BSI型分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；芦荟苷与茶多酚中的（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）标准品（成都普思生物科技有限公司，批号分别为ps14082901、ps14110401，纯度均大于98%），荟酚杀菌防腐剂（湖北省药用植物研发中心自制，批号分别为150322、150323、150324、150325、150326，以芦荟苷、EGCG计均不得少于0.08 mg/mL），荟酚杀菌防腐剂阴性对照微乳（湖北省药用植物研发中心自制），乙腈、甲醇（色谱纯，美国天地公司），其他试剂均为分析纯，水为去离子水。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相分别为：乙腈∶水=25∶75、0.1%磷酸水溶液∶甲醇=68∶32；流速0.7 mL/min；柱温35 ℃；检测波长分别为355、279 nm，进样量5 μL，理论板数按芦荟苷峰计算应不低于2 000，按（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）峰计算应不低于10 000。
1.2.2 溶液的制备
1）标准品溶液的制备。准确称取芦荟苷标准品0.22 mg，置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容、密塞摇匀，配制成质量浓度为0.11 mg/mL的芦荟苷标准溶液；取（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯对照品1 mg，精密称定，加甲醇溶液制成每1 mL含（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯0.1 mg的溶液备用。
2）供试品溶液的制备。精密量取25 mL样品，过D101型大孔吸附树脂，先用12倍量柱体积的水洗脱后，再用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，洗脱流速为3.0 mL/min，合并洗脱液，浓缩蒸干，残渣加甲醇溶解，过滤，定容到2 mL，密塞、摇匀，配制成供试品溶液，临用前以0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
3）阴性对照溶液的制备。按确定的处方和工艺，将荟酚杀菌防腐剂制成不含芦荟及绿茶提取物的制剂，参照供试品溶液的制备方法，配制阴性对照溶液。
1.2.3 系统适用性试验 分别准确量取5 μL供试品溶液、阴性对照溶液和芦荟苷及EGCG标准品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，按“1.2.1”的色谱条件进行分析。
1.2.4 标准曲线的绘制 精密称取芦荟苷标准品，加甲醇溶解、定容、密塞摇匀，配制成0.044、0.088、0.132、0.176、0.220、0.264 mg/mL的芦荟苷系列标准溶液；精密称取EGCG标准品，加甲醇溶液制成质量浓度分别为0.081 6、0.326 4、0.734 4、1.305 6、2.040 0、2.937 6 mg/mL的EGCG系列标准溶液，按“1.2.1”的色谱条件进行分析，分别以芦荟苷和EGCG的质量浓度为横坐标、以相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.5 方法学考察
1）进样精密度试验。分别准确量取5 μL芦荟苷及EGCG对照品溶液，按“1.2.1”的色谱条件，注入液相色谱仪测定，重复连续进样5次，并记录芦荟苷及EGCG的峰面积。
2）稳定性试验。取同一供试品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件，分别于0、3、6、9、12、24 h进样，注入液相色谱仪测定，分别计算芦荟苷及EGCG峰面积的RSD。
3）重现性试验。取同一批号样品5份，每份25 mL，参照供试品溶液的制备，依次配制供试品5份，准确量取5 μL按“1.2.1”的色谱条件，注入高效液相色谱仪测定，分别计算芦荟苷及EGCG含量的RSD。
1.2.6 加样回收率试验 准确量取已知含量的样品5份，分别添加芦荟苷及EGCG标准储备溶液，参照“1.2.2”中的方法制备供试品溶液5份，按“1.2.1”的色谱条件测定，计算芦荟苷及EGCG的加样回收率。
1.2.7 样品中芦荟苷及EGCG的含量测定 分别称取各批号荟酚杀菌防腐剂，参照“1.2.2”中的方法制备各供试品溶液，参照“1.2.1”的色谱条件测定，每批样品平行测定3份，取其平均值。
2 结果与分析
2.1 线性关系
将标准系列溶液每个浓度分别进样3次，取峰面积的平均值作为纵坐标，以对照品的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，芦荟苷回归方程：y=71.196x-0.337 6，r=0.999 2；EGCG回归方程：y=5.795 8x+4.333 0，r=0.999 1。结果表明，芦荟苷在0.044～0.264 mg/mL、EGCG在0.081 6～2.937 6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
2.2 系统适用性试验
芦荟苷及EGCG峰与其相邻峰分离度良好、无其他杂质峰干扰，阴性对照制剂对芦荟苷及EGCG色谱峰的分离无干扰。HPLC图谱见图1～图6。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 分别连续进样5次测定芦荟苷及EGCG峰面积，计算其峰面积的RSD分别为1.23%、1.12%。结果表明，该仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 经计算芦荟苷及EGCG峰面积的RSD分别为0.50%、2.37%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.3 重现性试验 芦荟苷及EGCG的含量的RSD分别为0.96%、2.25%。结果表明，该测定方法重现性良好。
2.4 方法的准确度、检测限和定量限
加样回收结果（表1、表2）表明，该方法对芦荟苷及EGCG具有良好的加样回收率，荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及EGCG的平均添加回收率分别为98.25%、100.31%；相对标准偏差（RSD）分别为2.07%、1.42%，均符合测定要求。在所选定的检测条件下，仪器对芦荟苷及EGCG的检测限（LOD）分别为0.0073、0.010 8 mg/mL；在荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及EGCG的定量限（LQD）分别为0.022 0、0.032 3 mg/mL。
2.5 样品中芦荟苷及EGCG含量测定
3批荟酚杀菌防腐剂样品中芦荟苷及EGCG的含量见表3、表4。结果表明，3个批次荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及EGCG平均含量分别为0.095、0.090 mg/mL。相同工艺条件下制得的不同批次的荟酚杀菌防腐剂中，芦荟苷及EGCG含量上存在一定差别，这种差异可能是不同批次在制备过程中存在微小差异所致。
3 讨论
3.1 样品的前处理
荟酚杀菌防腐剂中存在一定量的乳化剂及助溶剂等基质，黏度较大易产生一定的干扰。为此，本试验对样品的前处理方式进行了改进，精密量取25 mL样品直接蒸干，残渣加甲醇溶解。该制样方法操作简单，但残渣中含有大量的乳化剂等基质，黏度很大，残渣在甲醇中的溶解度较小，过滤时较为困难；精密量取25 mL样品，过D101型大孔吸附树脂，先用12倍量柱体积的水洗脱后，再用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，洗脱流速为3.0 mL/min，合并洗脱液，浓缩蒸干，残渣加甲醇溶解，结果表明，该方法能够很好地除去制剂中的乳化剂及助溶剂等基质。
3.2 流动相的选择
荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷的含量测定方法可直接参照《中华人民共和国药典》2010版一部[6]的方法便能得到理想的分离效果。药典中关于茶多酚的含量测定中的流动相不是很常见，根据前期文献做了筛选，以甲醇∶水∶磷酸（21∶78.9∶0.1）[7]为流动相时图谱中EGCG峰拖尾较为严重；流动相为0.1%磷酸水溶液∶甲醇（68∶32）[8]时，得到的图谱分离效果较好。考虑到实际生产情况，故最终选择0.1%磷酸水溶液∶甲醇（68∶32）作为流动相。
3.3 结论
本试验建立了RP-HPLC测定荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及EGCG含量的方法。该方法简便、快速、准确、灵敏，可作为荟酚杀菌防腐剂中芦荟苷及EGCG含量测定的方法。此研究结果可为某些乳剂剂型中同时存在乳化剂和助溶剂对测定存在较大干扰的情况下选择适宜的前处理方式及流动相提供方法参考。
参考文献：
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[8] 刘锦文，李红玉，石瑞君，等.高效液相色谱法测定茶多酚中EGCG和ECG的含量[J].食品工业科技，2010，11（5）：372-374.