针刺法对脑缺血的实用性
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处理方法与取材针刺组采用"醒脑开窍"针法[5,6]，选取人中、内关、三阴交、极泉等穴，参考《实验针灸学》[7]大鼠标准穴位定位图谱取穴。分别于造模成功后3h和6h介入治疗，治疗时，人中穴向鼻中隔方向斜刺0.2寸～0.3寸，用重雀啄手法，至大鼠肢体出现明显抽动或眼球湿润流泪为度[7]，快速起针不留针；双侧内关穴直刺进针，采用捻转提插泻法，行针1min，留针30min；三阴交穴沿胫骨后缘与皮肤成45度角斜刺，进针0.1寸~0.2寸，用提插补法，使大鼠下肢抽动3次为度，留针30min；极泉穴直刺0.2寸，用提插法使大鼠上肢抽动3次为度，快速起针不留针。每日1次，共治疗3次。药物组在造模成功5h后予以腹腔注射香丹注射液1.5mL/100g，每日1次。假手术组在游离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉后，敷蘸有生理盐水的纱布30min，然后用庆大霉素消炎后封闭皮肤切口，不给予任何处理。模型组造模成功后不治疗。标本采集：不同时机介入治疗72h后，各组大鼠断头取血5mL，静置100min，低温离心(4℃，3000rpm，15min)分离血清，-70℃保存待测；在冰盘上迅速取出大脑，切除小脑及脑干部分，分理大脑右侧半球，加入2ml生理盐水后用匀浆机匀浆，离心取上清，-70℃保存待测。观察指标采用羟胺氧化法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。统计学分析采用SPSS统计软件进行数据统计分析，所有数据均以均数±标准差（X±S）表示，各组组间差异采用单因素方差分析（One-WayANOVA），继以LSD检验，以P<0.05作为具有显著性差异的标准。
结果
不同时机介入"醒脑开窍"针刺法对血清SOD活性的影响与假手术组比较，模型组和针刺各组血清SOD活性均明显升高，有显著性差异(P<0.01)，药物组有升高趋势，无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，5h药物组明显降低，有显著性差异(P<0.01)，3h、6h针刺组均呈升高趋势，无显著性差异(P>0.05)；5h药物组与针刺各组比较，5h药物组明显降低，有显著性差异(P<0.01)。针刺各组间比较，6h针刺组血清SOD活性高于3h针刺组，无显著性差异(P>0.05)。见表1。不同时机介入"醒脑开窍"针刺法对血清MDA含量的影响与假手术组比较，3h针刺组血清MDA含量明显升高，有显著性差异(P<0.01)，其余各组均呈升高趋势，无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，3h针刺组MDA含量升高明显，有显著性差异(P<0.01)，6h针刺组呈升高趋势，5h药物组呈降低趋势，均无显著性差异(P>0.05)；与3h针刺组比较，6h针刺组与5h药物组MDA含量均降低明显，有显著性差异(P<0.01)；与6h针刺组比较，5h药物组血清MDA含量低于6h针刺组，无显著性差异(P>0.05)。2.3不同时机介入"醒脑开窍"针刺法对脑组织SOD活性的影响与假手术组比较，5h药物组脑组织SOD活性明显升高，有显著性差异(P<0.05)，3h针刺组SOD活性呈升高趋势，模型组及6h针刺组呈降低趋势，均无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，3h针刺组与5h药物组脑组织SOD活性均明显升高，有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，6h针刺组呈降低趋势，无显著性差异(P>0.05)；与3h针刺组比较，6h针刺组脑组织SOD活性明显降低，有显著性差异(P<0.01)；与6h针刺组比较，5h药物组脑组织SOD活性明显升高，有显著性差异(P<0.01)。见表2。2.4不同时机介入"醒脑开窍"针刺法对脑组织MDA含量的影响与假手术组比较，模型组及6h针刺组脑组织MDA含量明显降低，5h药物组明显升高，均有显著性差异(P<0.05，p<0.01，P<0.01)，3h针刺组呈升高趋势，无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，5h药物组则升高明显，有显著性差异(P<0.01)，3h针刺组呈升高趋势，6h针刺组呈降低趋势，均无显著性差异(P>0.05)；与3h针刺组比较，6h针刺组MDA含量呈降低趋势，5h药物组呈升高趋势，均无显著性差异(P>0.05)；与6h针刺组比较，5h药物组MDA含量明显升高，有显著性差异(P<0.01)，3h针刺组MDA含量升高，但无显著性差异(P>0.05)。
讨论
SOD与MDA是评价机体内氧化与抗氧化平衡体系的重要指标，正常生理情况下，机体内由完整的酶和非酶物质组成的抗氧化系统维持着机体的功能正常和结构的完整。当脑缺血发生时，脑组织氧供减少，造成钙泵和Na+-K+-ATPase活性降低，Na+-Ca2+交换受抑，细胞内钙难以泵出胞外[8]，同时脑组织中兴奋性氨基酸(EAA)的含量显著增加，可通过受体途径增加细胞浆的Ca2+水平，胞浆Ca2+的大量增加可进一步诱导自由基反应，产生大量自由基[9]。研究表明，脑损伤由于局部缺血、缺氧引起自由基含量增加，超过了SOD的清除能力，导致大量自由基快速蓄积，可出现继发性脑水肿和脑损害。大量自由基攻击血管内皮细胞和平滑肌细胞，会引起血管扩张，管壁肿胀、通透性增加，血脑屏障破坏，加重脑水肿的形成和发展；自由基还可损害富含脂质的神经元等，发生脂质过氧化反应，引起蛋白质变性、酶丧失活性、神经元死亡或凋亡等[10-12]。SOD作为一种蛋白酶，能够通过歧化反应清除超氧阴离子自由基，是一种主要的自由基清除剂。而MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量高低在一定程度上可直接或间接反映脂质过氧化水平和细胞损伤程度[13,14]。Zea-Longa于1989年采用线栓法成功制备了脑缺血再灌注模型，该方法可准确调控脑缺血-再灌注时间，缺血部位恒定，且回抽留于大鼠体表的线头，可实现再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态，适用于对缺血敏感性、耐受性以及再灌注损伤和治疗时间窗的研究，该模型制备方法应用最为广泛[15]。模型成功的主要评判标准是大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧前肢为重的偏瘫症状。本实验动物模型制成后出现的症状、体征与以往研究基本一致，提示成功复制了脑缺血再灌注的大鼠模型。脑缺血再灌注属中风病范畴。醒脑开窍针法是石学敏教授治疗中风病(脑卒中)多年临床实践经验的总结，他提出"窍闭神匿，神不导气"是中风病的根本病机，针对病机创立了"醒脑开窍"大法，将"治神和调神"作为贯穿中风病各期治疗的主线，主选"内关"、"人中"开窍启闭，醒神调神治其标，"三阴交"滋补肝肾，育阴潜阳以治其本[16]。人中穴为督脉与手、足阳明经之会穴，督脉上行入脑达巅，故泻人中可通调督脉、开窍启闭、醒元神；内关为手厥阴心包经络穴，八脉交会穴，通于阴维，有宁心调血安神、疏通气血之功；三阴交补三阴、益脑髓、调气血、安神志；配合手少阴心经的极泉穴宽胸宁神，调气和血，解痉止痛。诸穴合用从而达到明达元神、平衡阴阳、调和气血、疏经活络的疗效促进神志以及肢体功能的恢复。脑梗死主要是脑血液供应障碍引起缺血、缺氧，导致局部性脑组织缺血性坏死或脑软化，并在梗死病灶区周围存在缺血半影区形成梗死灶所致[17]。研究表明，脑卒中发病48h后神经症状就不再进展；6h内是挽救脑细胞死亡的关键；72h内是挽救缺血性半影区的关键[18,19]。为此，我们选择不同的时间点（3h和6h）介入治疗，观察不同时机介入治疗后体内SOD活性和MDA含量的变化，探讨不同时机介入针刺法疗效的内在机制。研究结果显示，3h针刺组、6h针刺组血清SOD活性均较模型组有所升高，3h针刺组MDA含量明显高于模型组，而6h针刺组MDA含量呈降低趋势；药物组血清SOD活性较模型组明显降低，MDA含量较模型组亦有所降低。因此推测早期不同时间介入针刺法对血清中SOD活性和MDA含量具有一定调节作用，可通过启动机体在应激状态下的内源性自我保护机制，增加血液中SOD的活性，加速机体内大量氧自由基的清除。3h介入治疗可使SOD活性增加，同时脑缺血再灌注进行性加重会产生大量氧自由基堆积，使MDA生成增加，而增强的SOD活性短时间内尚不足以完全抑制脂质过氧化反应，使MDA生成显著降低，因而血清SOD活性升高的同时，MDA含量也呈升高趋势。当6h介入治疗时，SOD活性不断升高，其清除率已远远高于体内有害自由基的生成率，故MDA含量升高缓慢。药物组中血清SOD消耗性增加，清除能力增强，但未能调动机体内在调节机制及时生成更多的SOD，因而血清SOD活性明显降低。而观察脑组织内SOD活性和MDA含量变化的，我们发现6h针刺组在治疗72h时SOD被消耗到最低，MDA含量也降至最低，提示此时正是机体抵抗大量氧自由基伤害、挽救脑细胞死亡的关键时期，SOD消耗增加，MDA生成也在减少；3h针刺组脑组织SOD活性及MDA含量均有所升高，推测在脑缺血再灌注早期，脑缺血再灌注本身作为一种应激原，通过内在自我保护机制诱导SOD活性升高，消耗大量生成的氧自由基，但随着再灌注时间的延长引起的进行性损伤加重不可避免的导致MDA的生成超出SOD的清除力，3h针刺可能重新启动并增强了机体内在抗应激机制，促进SOD活性被大量消耗后又快速恢复，加速氧自由基代谢，减少细胞结构和功能损伤，减轻脑细胞的水肿坏死，从而降低脑组织的损伤程度。因此，本实验得出以下结论：不同时机介入"醒脑开窍"针刺法和药物治疗均可发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用，而3h针刺介入的疗效要优于6h针刺介入和5h药物干预。综上所述，脑缺血再灌注时，机体在创伤应激的作用下生成大量的氧自由基(O22+)，SOD消耗增加、活性下降，早期针刺治疗能够促使机体启动自我保护作用机制，增强SOD活性，清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，发挥保护脑细胞的作用；且针刺介入治疗越早，SOD释放就越多，脑组织局部脂质过氧化反应就越少，自由基对脑组织的损害就越低。本研究为脑血管疾病临床早期介入治疗提供了实验依据。
作者：闫明茹 郑宇 孙洁 任晓暄 杨磊 郑玲 张露芬 单位：中国中医科学院广安门医院推拿科 中国核工业北京 北京中医药大学针灸推拿学院