丙氨酰―谷氨酰胺对重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫功能的影响

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摘要：目的：研究肠内及肠外营养途径给予丙氨酰-谷氨酰胺（Gln）对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠道免疫功能的变化，探讨其作用机制。方法：以假手术组（20只）大鼠作为对照，将60只SAP组的大鼠随机分为4组：EN组、EN+Gln组、PN组、PN+Gln组。72h后处死大鼠，分别取上述5组大鼠回盲部肠管，ELISA法检测回肠内容物分泌型IgA（S-IgA）的含量，流式细胞法检测肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平。结果：与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物S-IgA的含量明显降低，差别具有统计学意义;与对照组相比，SAP组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差别具有统计学意义。与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义;与PN组相比，PN+Gln组大鼠S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义。结论：肠内营养添加丙氨酰-谷氨酰胺可以提高肠道局部CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和巨噬细胞水平，提高增强肠道局部免疫反应，早期肠内营养并添加丙氨酰-谷氨酰胺具有治疗SAP的作用。

关键词：重症急性胰腺炎，谷氨酰胺，肠道免疫

基金项目：2014福建省科技项目计划，编号：2014D030

谷氨酰胺（Gln）是人体最多的游离氨基酸之一，在生理情况下是非必需氨基酸。在某些危重疾病，如急性胰腺炎时，由于消耗明显增多等原因导致Gln明显缺乏。补充谷氨酰胺可以治疗重症急性胰腺炎，但具体机制尚未完全明了，本文拟通过动物试验研究丙氨酰-谷氨酰胺对重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫功能的影响，探讨其可能的作用机制。

1. 资料与方法

1.1实验动物 采用福建医科大学实验动物中心的清洁级SD大鼠，体重180-240g，经适应性喂养24h后用于实验。

1.2实验动物分组 购买来的SD大鼠，适应性喂养24h，随机分为SAP组（60只）和对照组（20只）。SAP组又随机EN组、EN+Gln组和PN组、PN+Gln 4组。

1.3动物模型的制备 通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠溶液建立大鼠重症急性胰腺炎模型，采用传统的Aho【1】逆行胰胆管注射法建立大鼠SAP模型。SAP大鼠术中将3.5%牛磺胆酸钠溶液用微量注射泵恒速注入胰胆管内，用量1ml/kg体重，以0.2ml/min的速度注射完毕;对照组大鼠术中使用生理盐水进行胰胆管灌注，剂量及方法同SAP组。EN组采取胃十二指肠置管方法进行肠内营养，PN组采取尾静脉留置插管方法进行肠外营养。对照组进行假手术后给予自由普通饮食。

1.4营养制剂 EN营养制剂组分为：水、麦芽糊精、酪蛋白、植物油、膳食纤维（大豆多糖等）、矿物质、维生素和微量元素等。每100ml提供总能量10Okal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为61：20：19。PN营养制剂：采用50%葡萄糖、20%复方氨基酸和20%脂肪乳剂作为基本营养成分，每100ml提供总能量100kal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为56：19：25。Gln制剂：EN+Gln组及PN+Gln组动物每天肠内及肠外营养液中添加0.4 g/Kgd纯度为98%的丙氨酞-谷胺酞胺双肽（力肽注射剂，华瑞公司产品）。所有实验动物可自由饮水。营养制剂的剂量为每天250 mL/kg，麻醉苏醒后2小时开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24小时内均匀输注。

1.5实验方法

1.5.1肠内容物SIgA含量：取盲肠内容物，加入4ml生理盐水，4oC冰箱震荡过夜，4000rpm离心10分钟，取上清液按ELISA试剂盒（购自上海蓝基生物科技有限公司）操作方法检测。

1.5.2肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞检测：在大鼠小肠的近端空肠5 cm以下处取2 cm 长的空肠（回盲部肠管）匀浆后，4℃条件下，准确称量0.3 g肠组织，剪碎，移入玻璃匀浆器，然后加入预冷的生理盐水至总体积3 mL，在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研磨，制备10%肠组织匀浆。将匀浆液低温离心（4℃，3 500 rpm）10 min，取上清液，使用流式细胞仪（美国贝克曼公司的COULTER？ DNA PREP？ Reagents Kit）测定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比及CD68+巨噬细胞的百分比。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS17.0统计软件进行处理分析，以数据用x±s表示，组间参数及两组参数之间的比较采用相关样本的非参数检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 SAP组和对照组大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物S-IgA的含量明显降低，差别具有统计学意义;与对照组相比，SAP组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差别具有统计学意义。详见下表1。

表1 SAP组和对照组大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

2.2 EN组及PN组SAP大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义（F值依次为98.305、111.37、23.158、89.848、86.895，P值均<0.001）;与PN组相比，PN+Gln组大鼠S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义（F值依次为0.039、3.052、2.346、2.461、0.625，P值依次为0.846、0.098、0.143、0.134、0.44）。详见下表2。

表2 EN组及PN组SAP大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

3.讨论

重症急性胰腺炎是临床常见重症疾病，因其易破坏肠道功能屏障导致胰腺组织细菌感染、全身炎症反应综合征甚至多器官功能衰竭，故病情凶险，病程进展快，死亡率高达20%-30%[2]。如何保护肠道功能屏障是治疗重症急性胰腺炎的首要任务，而肠道免疫功能屏障是肠道功能屏障的重要组成部分，其在保护SAP肠道功能屏障中的作用日益突出。大量实验结果[3-4]表明，SAP时谷氨酰胺明显缺乏，补充谷氨酰胺具有治疗SAP的作用，而谷氨酰胺对SAP是否具有保护肠道免疫功能屏障的作用目前研究较少。

肠道免疫屏障由肠上皮细胞（intestinalepithelial cell，iEC）、肠上皮内淋巴细胞（intestinal intraepithelial lymphocyte，iIEL）、固有层淋巴细胞（lamina proprial lymphocyte，LPL）、派伊氏结（peyer'patch，PP）和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞分泌型免疫球蛋白A（sIgA）构成[5]。其主要功能是由相关淋巴样组织通过分泌sIgA 发挥抗感染的体液免疫以及细胞毒性的细胞免疫。

本研究结果表明，与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物细菌S-IgA的含量、肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，说明SAP时肠道免疫功能屏障明显受损。由于谷氨酰胺不稳定，常与丙氨酸结合制成稳定的Gln双肽。本实验中，分别应用肠内营养及肠外营养两种不同途径添加Gln。结果显示，与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义;与PN组相比，PN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义。说明肠内营养添加Gln具有明显提高肠道局部体液免疫及细胞免疫，保护肠道免疫功能屏障，从而达到治疗SAP的作用。

参考文献：

[1] Gerlach H. Risk management in patients with severe acute pancreatitis[J].Crit Care，2004;8（6）：430

[2] Aho HJ，Koskensalo SM，Nevalainen TJ.Experimental pancreatitis in the rat.Sodium taurocholate induced acute haemorrhagic pancreatitis[J].Scand J Gastroenterol，1980，15（4）：411-416.

[3] Gamrin L， Essen P， Forsberg AM， Hultman E， Wernerman J： A descriptive study of skeletal muscle metabolism in critically ill patients： free amino acids， energy-rich phosphates， protein，nucleic acids， fat， water， and electrolytes. Crit Care Med 1996，24：575-583.

[4] Roth E， Funovics J， Muhlbacher F， Schemper M， Mauritz W， SpornP， Fritsch A： Metabolic disorders in severe abdominal sepsis：glutamine deficiency in skeletal muscle. Clin Nutr 1982，1：25-41.

[5] 徐凯进，李兰娟.肠道正常菌群与肠道免疫[J].国外医学・流行病学传染病学分册，2005，32（3）：181-183.