基于尿液代谢组学研究黄连和胆黄连对热证药效作用机制的差异性お
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[摘要]利用超高效液相色谱与LTQOrbitrapMS串联质谱仪的尿液代谢组学方法，研究黄连、胆黄连对热证模型大鼠药效作用机制的差异性，探讨胆黄连炮制的科学性。采用大鼠灌胃附子、干姜、肉桂水煎液1.5 d并皮下注射干酵母混悬液致热证模型，给药1.5 d后采集各组大鼠造模后0～6，6～1.2，1.2～2.4 h的尿样；采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLSDA）法等技术进行数据处理。正常组与模型组在0～6，6～1.2 h达到分离，1.2～2.4 h出现重叠，分离趋势不明显；黄连组和胆黄连组0～6 h大鼠尿样与模型组分离，接近于正常组；黄连组和胆黄连组在0～6，6～1.2 h大鼠尿样有分离趋势。鉴定30个与热证相关的差异代谢物，结果表明，黄连经猪胆汁炮制后对热证模型大鼠的整体药效作用发生改变，胆黄连解热作用具有多靶点、起效快、作用强度较强的特点，主要通过对胆碱能神经递质、氨基酸代谢、嘌呤代谢的调节发挥解热作用。
[关键词]黄连； 胆黄连； 热证； 尿液代谢组学
黄连味苦，性寒，具有泻火解毒、清热燥湿的功效，主要含有小檗碱、巴马汀、药根碱等生物碱类化学成分[1]。《本草纲目》对黄连的炮制方法记载详细，如治本脏之火，生用黄连；治肝胆实火，以猪胆汁浸炒黄连等。在制药论中，黄连经猪胆汁炮制后寒性增强，有“寒者益寒”、“从制”的炮制理论。目前，对黄连炮制品相关报道较多[23]，但在胆黄连炮制机制的研究方面尚缺少现代分析技术的研究。本文在前期研究的基础上，通过尿样代谢组学方法，以大鼠灌胃温里药并皮下注射干酵母造成热证的模型方法[4]，采用超高效液相色谱与离子肼串联高分辨质谱仪（UPLC/LTQOrbitrapMS）联用技术，分析大鼠尿液内源性代谢物的变化及代谢通路的不同，对黄连与胆黄连治疗热证的药效作用差异性进行深入研究，以期探讨黄连用猪胆汁炮制的科学内涵。
1材料
UPLC/LTQOrbitrapMS（Linear ion trap quadrupoleorbitrap hybrid mass spectrometer）高性能串联质谱仪，MassLynxV4.1工作站（美国Thermo Fisher）；MC3B电脑数字式体温计（欧姆龙大连有限公司）；CENCO型涡旋仪（荷兰Breda公司）；Biofuge Stratos型低温高速离心机（德国Heracus公司）；LABCONCO型冷冻干燥机（美国LABCONCO公司）。
黄连、干姜、肉桂、黑附子均购自于大连权健中药饮片有限公司，经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎， 姜科植物姜Zingiber officinale Rose的干燥根茎，樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥树皮，毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx 的子根；干酵母（安琪酵母有限公司）。 色谱级甲醇、乙腈购于Merck INC（Germany），甲酸（色谱级）购于Dikma technology INC （USA），超纯水由MilliQ system （USA） 制备。赖氨酸、乙酰胆碱、5甲基尿苷、胆碱、脯氨酸甜菜碱、DL高半胱氨酸、N乙酰基L组氨酸、N6乙酰基L赖氨酸、葫芦巴碱、5甲基胞苷、7甲基鸟嘌呤、2氨基丁酸、黄嘌呤、脱硫生物素、蛋氨酸、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、4乙酰氨基丁酸、泛酸、2呋喃甲酰基甘氨酸、3吲哚乳酸、3甲基L组氨酸、S腺苷甲硫氨酸、尿酸、尼克酰胺、酪氨酸、腺嘌呤、精氨酸、犬尿酸、核黄素均购自于Sigma公司。
Wistar大鼠，雌性，（200±20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号SCXK（辽）20100001。早晚各测定大鼠肛温1次，连测3 d，选取肛温在3.70～3.80 ℃，波动在05 ℃ 以内者纳入实验。
2方法
2.1胆黄连的制法及供试品溶液的制备
2.1.1胆黄连的制法取黄连饮片，加含1.5%猪胆汁的水溶液（每100 g黄连加40 mL）拌匀，闷润1 h，95 ℃下翻炒1.9 min，即得。
2.1.2供试品溶液的制备取胆黄连饮片称重，加10倍量水浸泡05 h，煎煮1 h，绢布滤过，药渣再加8倍量水煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩至相当于生药量01 g・mL-1。同法制成黄连供试品溶液。
2.2分组与给药
40只大鼠，随机分为4组，每组10只。Ⅰ组：正常组；Ⅱ组：热证模型组；Ⅲ组：黄连组；Ⅳ组：胆黄连组。每日8：00，Ⅰ组灌胃4 mL生理盐水，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组灌胃4 mL附子、干姜、肉桂的水煎液（1∶1∶1，1 g・mL-1），持续造模1.5 d。第1.6天开始，除Ⅰ组外，其他组每日上午8：00灌胃4 mL附子、干姜、肉桂的水煎液（1∶1∶1，1 g・mL-1）；每日1.6：00，Ⅲ，Ⅳ组分别灌胃黄连、胆黄连药液2 g・kg-1，Ⅰ，Ⅱ组分别灌胃等量生理盐水，中药预防治疗连续1.5 d。在第3.1天早8：00，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组皮下注射20%干酵母混悬液（10 mL・kg-1），造成热证模型，Ⅲ，Ⅳ组注射后立即分别灌胃黄连、胆黄连药液2 g・kg-1后，将各组每只大鼠置代谢笼中，接收0～6，6～1.2，1.2～2.4 h尿液，于1.2 000 r・min-1离心10 min，取上清液，于-80 ℃储存。实验中记录各组给药后0，3，6，9 h的直肠体温，并计算各时间点的体温差值（T=造模后体温值-造模前体温值）。
2.3尿液样品的处理和质控样品的制备
取尿样在冰上融化，涡旋混匀。取100 μL尿液于1.5 mL离心管，加入400 μL甲醇，涡旋2 min，在1.4 000 r・min-1，4 ℃下离心10 min，取上清液400 μL冻干后，用水乙腈（95∶5）400 μL复溶。在分析序列中，每 8 个样本加入1个质量控制（QC）样本。QC尿样样本的制备：所有尿样于室温下解冻，每个尿样吸取50 μL于同一5 mL 离心管中，涡旋1 min混合均匀，按照上述尿样样品的处理方法制备QC尿样，用于UPLC/LTQOrbitrapMS分析。在分析序列中，每8个样本，加入1个QC尿样。
2.4色谱质谱条件
色谱条件： ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters），柱温为40 ℃，进样室温度为4 ℃。流动相A为01%甲酸水，流动相B为01%甲酸乙腈，流速为03.5 mL・min-1。梯度洗脱（0～1 min，95%A；1～1.8 min，95%～50%A；1.8～1.85 min，50%～100%A；1.85～20 min，100%A）。电喷雾离子源（ESI），正离子扫描检测；毛细管电压为40 V，电喷雾电压为4 500 V；雾流为2.5 μA；毛细管温度为3.2.5 ℃；鞘气流速4.5 arb，辅气流速8 arb；扫描时间为03 s；分辨率为3万；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 50～1 000。进样量5 μL。样品不经紫外检测器直接导入质谱系统检测。
2.5数据处理
采用SIEVE 1.2软件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）进行色谱峰识别及峰匹配，得含有m/z、保留时间、峰面积、样品名称的csv格式文件，在原始峰表中去除QC样本测定相对标准偏差（RSD）大于30%的变量，依据80%规则去除零值，处理原始峰表后，将峰表归一化并引入SIMCAP（version 1.10，Umetrics AB，Sweden）数据处理软件，采用主成分分析法（principal component analysis， PCA）和偏最小二乘判别分析法（partial least squaresdiscriminant analysis，PLSDA）对各组大鼠尿液的代谢物组进行分析。通过VIP值（1）及内源性代谢物在正常组与模型组之间的t检验，筛选与热证相关的潜在生物标志物，根据精确相对分子质量和串联质谱结果及与HMDB （http：//www. hmdb. ca/）和METLIN （http：//metlin. scripps. edu/）等代谢产物和质谱数据库进行质谱信息匹配，对可能的潜在标志物进行初步鉴定，再用对照品质谱进行验证。所有数据采用SPSS 1.30软件中oneway ANOVA 进行分析，并用±s表示。
3结果
3.1黄连经猪胆汁炮制前后对热证大鼠体温的影响
各组大鼠不同时间点的体温差值见图1，与正常组比较，模型组在3，6，9 h的体温差值有非常显著性差异，且体温在3～9 h显著性升高，并出现烦躁多动、口渴喜饮、皮毛无光泽、竖毛等热证体征现象，表明形成热证模型。与模型组比较，胆黄连组和黄连组在3 h的体温差值均显著性降低，其中，胆黄连组更接近于正常组的体温差值；其他时间点的体温差无明显变化，但胆黄连在各时间点的体温差值一直在模型组的下方，优于黄连组。实验中曾测定造模后1.2，2.4 h各组大鼠的体温，但模型组造模后1.2，2.4 h的体温与正常组无显著性差别。
3.2尿液代谢组学
3.2.1大鼠尿样液相质谱检测结果本实验采用正离子模式检测，分离效果良好，结果见图2。从基峰离子色谱图（BPI）中可以看出各组尿样中物质的差异，在20 min有效洗脱时间内获得良好的分离和响应效果。
3.2.2正常组与模型组的尿样代谢变化正常组和模型组大鼠不同时间段的尿样PCA分析结果见图3，模型组在造模后0～6 h，与正常组有分离的趋势；6～1.2 h大鼠尿样与正常组完全分离；1.2～2.4 h大鼠尿样与正常组重新交集，分离趋势不明显。这与热证模型造模过程中体温变化趋势相吻合，表明造模成功。
3.2.3黄连经猪胆汁炮制前后干预热证模型大鼠尿样代谢变化各组0～6 h尿样的PLSDA得分图见图4，各组基本分离开，黄连组和胆黄连组均接近于正常组，且黄连组与胆黄连组有分离趋势，其中正离子模式下模型的评价指标为R2X=061.8，
Q2=04.97；各组大鼠6～1.2 h尿样的PLSDA得分图表明，正常组与模型组完全分离，黄连组和胆黄连组出现向模型组靠近的趋势，其中模型的评价指标为R2X=063.9，Q2=03.3.3，结果表明，黄连、胆黄连在0～6 h解热作用最显著，6～1.2 h的解热作用减弱。
3.2.4潜在生物标志物的鉴别正离子模式下以保留时间为0620 min，m/z 1.4.61.1.7 7 的离子为例，根据精确相对分子质量、计算分子的不饱和度、结合同位素峰相对强度进行筛选，推断其化学式是C7H1.6NO2。该离子在串联质谱中产生m/z 8704.5 7的碎片，经计算确认碎片离子为[M-CH3COO]+，经数据库搜索确认为乙酰胆碱（acetylcholine），其串联质谱图及裂解规律见图5。与热证相关的潜在生物标志物鉴定了30种化合物，与正常组比较，这些生物标志物的变化趋势结果见表1。
4讨论
4.1热证模型的确定
本文前期研究工作曾采用大鼠灌胃中药提取液造热证模型，发现大鼠出现躁动、兴奋、耳缘发红等
症状，但是体温无显著变化，由于皮下注射干酵母亦是造成发热的常用造模方法[4]，因此本研究采用灌胃中药提取液并注射干酵母的方法造成热证模型。实验中对大鼠性别亦进行考察，发现正常雌、雄大鼠的体温无显著差异，亦有文献资料表明雌性大鼠机体中激素的变化对发热大鼠的体温无显著影响[5]，因此本实验选择雌性大鼠进行研究。
4.2潜在生物标志物的生物学意义分析
采用SPSS 1.30软件对各组间潜在生物标志物相对峰面积进行oneway ANOVA分析，结果见图6。与正常组比较，模型组0～6 h尿样中与嘌呤代谢相关的次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、5甲基尿嘧啶核苷、5甲基胞苷、黄嘌呤、7甲基鸟嘌呤显著升高；6～1.2 h尿样中尿酸显著升高。与文献报道的大鼠皮下注射干酵母致发热，使脑组织中嘌呤代谢产物AMP，GMP，IMP和5′GMP显著升高的结果相一致[4， 6]。实验中发现在6～1.2 h黄连组和胆黄连组尿酸均向正常组显著调节，黄连组亦对腺嘌呤有调节作用，表明黄连、胆黄连均对嘌呤代谢有调节作用。
与正常组比较*P
由图6可知，与正常组比较，模型组中胆碱、乙酰胆碱均显著升高，胆黄连组在0～6 h胆碱极显著降低（P
尼克酰胺是一种水溶性维生素，在机体内合成辅酶NAD+或NADP+，参与体内脂质代谢、组织呼吸的氧化和糖类无氧分解后，转变为NADH或NADPH。与正常组相比较，模型组6～1.2 h大鼠尿样中尼克酰胺显著降低，表明热证模型大鼠机体脂质、糖类及细胞氧化代谢增强，产生大量能量，增加了ATP生成，机体产热较多，造成体温升高。黄连组尼克酰胺向正常组显著回调，表明黄连通过抑制糖代谢、脂代谢等作用方式达到降低体温的作用。
与正常组比较，模型组在0～6 h大鼠尿样中蛋氨酸、2呋喃甲酰基甘氨酸、N6乙酰基L赖氨酸、N乙酰L组氨酸、脯氨酸甜菜碱[9]、赖氨酸显著升高；在6～1.2 h大鼠尿样中酪氨酸、蛋氨酸和精氨酸显著降低，色氨酸降解产物犬尿酸降低，本研究结果与干酵母诱导热证致机体氨基酸代谢异常的文献报道相一致[10]。另外，胆黄连组中N乙酰L组氨酸、脯氨酸甜菜碱、赖氨酸和酪氨酸与热证相关的4个差异代谢物，有显著向正常组回调的作用，但黄连组无显著改变。从预的差异代谢物的数量和含量变化可见，胆黄连对热证模型大鼠的干预治疗作用与黄连有明显区别，其对机体内源性物质的作用可能与途径、靶点增多有关。
4.3潜在生物标志物的代谢通路分析
采用MetPA软件分析与热证相关的代谢通路，并考察黄连、胆黄连对热证代谢通路的作用差异，见图7。模型组在0～6 h主要与缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸和辅酶A合成、嘌呤代谢和甘油磷脂代谢相关；在6～1.2 h与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成、尼克酸和尼克酰胺代谢、酪氨酸代谢相关。
A嘌呤代谢；B甘油磷脂代谢；C精氨酸和脯氨酸代谢；D缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成； E泛酸和辅酶A合成；F半胱氨酸和蛋氨酸代谢；G苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成；H尼克酸和尼克酰胺代谢；I酪氨酸代谢；J甾体激素合成；K谷胱甘肽代谢（图8，9同）。
给药后0～6 h，黄连组主要与尼克酸和尼克酰胺代谢、嘌呤代谢和甾体激素合成相关；胆黄连组主要与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A合成、酪氨酸代谢、甘油磷脂代谢和甾体激素合成相关，胆黄连调节的代谢途径较多，且与黄连组有明显区别，见图8。
给药后6～1.2 h，黄连组增加了谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢相关的代谢途径；胆黄连组未见改变，主要与氨基酸代谢相关，见图9。结果表明，黄连在猪胆汁炮制前后对热证干预治疗的作用方式发生变化。本课题组曾在药代动力学研究中发现胆黄连给药后小檗碱和巴马汀达峰时间明显提前，最大血药浓度显著提高，进一步验证了黄连经猪胆汁炮制后药效作用方式发生改变[11]。
机体发热时，基础代谢率会升高，因为能量消耗的需要，糖类、脂肪分解明显加强，并出现蛋白质分解和负氮平衡。本研究中亦发现模型组代谢通路分析主要与氨基酸代谢、甘油磷脂代谢相关，与核苷酸代谢相关的嘌呤代谢亦发生变化，结果均表明大鼠造模后基础代谢升高，黄连给药后主要通过对嘌呤、甘油磷脂、尼克酸和尼克酰胺等代谢发挥调节作用；胆黄连主要对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A合成、酪氨酸代谢、甘油磷脂代谢进行调节，结果表明黄连炮制前后可以调节发热大鼠的基础代谢，通过对物质代谢的改变发挥解热作用，但二者的具体药效作用机制有一定的差异性，结果表明，关于黄连经猪胆汁炮制的科学内涵仍需要进一步研究。
[参考文献]
[1]中国药典一部[S]201.5： 303
[2]王亚，杨军辉，芮天奇，等酒炙前后对上焦病症及肝脏能量代谢酶活性的影响[J] 南京中医药大学学报，201.4，30（4）：3.3.5
[3]王德珍，易俊，张翼，等 酒黄连、姜黄连、萸黄连最佳炮制工艺研究[J] 中药材，201.3，3.6（1）：3.5
[4]Tomazetti J， Avila D S， Ferreira A P， et al Baker yeastinduced fever in young rats： characterization and validation of an animal model for antipyretics screening [J] J Neurosci Methods， 2005， 1.4.7： 2.9
[5]Finley C， Zhang C F， Fewell J E Sex steroid levels near the term of pregnancy do not alter lipopolysaccharideinduced fever in oophorectomized rats [J] Exp Physiol， 201.5，100（3）： 3.2.3
[6]Liu H Y， Zhang L， Zhao B S， et al Hypothalamus metabolomic profiling to elucidate the tissuetargeted biochemical basis of febrile response in yeastinduced pyrexia rats [J] Chem Biol Interact， 201.5， 2.3.1： 61
[7]富杭育，郭淑英，高英杰，等桂枝汤对体温双向调节作用的机理探讨――对下丘脑乙酰胆碱和去甲肾上腺素作用的影响[J] 中国实验方剂学杂志，1.996，2（2）：8
[8]万红叶，孔祥英，李晓敏，等 不同寒热药性中药对酵母致热大鼠体温调节及温度敏感瞬时感受器电位离子通道（TRPs）蛋白的影响[J] 中国中药杂志，201.4，3.9（1.9）：3.81.3
[9]Guo M X， Gu H， Song Y L， et al Characterization of rational biomarkers accompanying fever in yeastinduced pyrexia rats using urine metabolic footprint analysis [J] J Pharm Biomed Anal， 201.4， 95： 68
[10]Gao X Y， Guo M X， Peng L， et al UPLC QTOF/MSbased metabolic profiling of urine reveals the novel antipyretic mechanisms of Qingkailing injection in a rat model of yeastinduced pyrexia [J] Evid Based Complement Alternat Med， 201.3， doi：org/101.1.5.5/201.3/864.74.7
[11]王静，陈悦，袁子民胆黄连在实热证大鼠体内的整合药代动力学与药效学的相关性[J]药学学报，201.6，5.1（1）：1.2.7