虾携带WSSV情况综述

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白斑综合征(whitespotsyndrome，wSs)是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一，是国际兽医局(OIE)规定需要报告的重要水生动物传染病…。wss由白斑综合征病毒(whitespotsyndromevims，WssV)引起，由于其给全世界对虾养殖业带来的危害巨大，且到现在仍无有效控制措施，所以世界各国都给以重点关注【2-5J。综合国内外文献报道，针对对虾体内wsSV在养殖全程中动态变化的调查较少，而现有报道研究也存在采样时间间隔较长，所体现的规律性不显著，未能详尽地反映其在整个养殖过程中的变动趋势。本研究旨在通过利用实时定量PCR技术，对精养池塘凡纳滨对虾体内wsSV携带情况进行跟踪，以期更有效和精确地反映对虾体内wssv携带量的变动规律，了解实际养殖生产中影响WSSV流行的因素，从而增加对该疾病可控性的认识，为预防养殖对虾病毒病暴发提供理论依据和参考。

l材料与方法

1．1实验场地选择

2010年7月一2010年11月，在广东省汕尾市红海湾鸿泰养殖场，从10口凡纳滨对虾高位精养池塘中随机抽取6口池塘进行采样。各池塘面积约为(0．45土0．1)hm2。池底铺设土工膜，无泥沙层，水深1．8～2．2m，养殖用海水经沙滤井过滤所得。每口池塘配备12～15kw／hm2的增氧设备(增氧机和底部增氧曝气管)。放养凡纳滨对虾∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)虾苗体长(1．0士0．1)cm，放苗量为270万尾／h“。

1．2材料及方法

1．2．1样品采集采样时间和频率按照养殖时间划分。在第一批放苗的五口池塘中随机选取卜3号3口池塘。从放苗日起，跟踪其养殖全程，时间从2010年7月31日到同年11月24日，约14d取一次样，跟踪时长116d。根据第一批的调查结果，在第二批放苗的5口池塘中随机选取4—6号3口池塘从放苗后的第10天起，进行养殖密集采样跟踪，时间从2010年9月18日到同年11月20日，采样时间为7天1次，跟踪时长63d。第二批采样池塘均因wSS暴发而中断养殖。所取虾样均为活虾，每次每塘随机采集对虾不少于15尾，分别采集对虾的鳃和肌肉组织，用浓度为75％的酒精固定。

1．2．2DNA的提取将每次采集的15尾对虾随机分成3组，每组5尾。任选一组，并分别取5尾虾的鳃或者肌肉组织混合成一个样品，鳃组织样品总质量为(15士2)mg，肌肉组织样品总克数为(20土3)mg。各组织样品DNA采用“天根海洋动物组织DNA提取试剂盒”(天根生物技术有限公司制造)提取。所提取的DNA样于一20℃保存待测。

1．2．3Real．timePCR引物和探针引物和探针的选择。根据DurandandLi曲tner【6J设计，由Invitrogen公司合成(表1)

1．2．4Real．timePcR反应参照Li曲tIler等旧1建立的实时荧光定量PcR法检测wSsV使用Eppendorf荧光定量PCR仪(EppendorfMastercy-clerRealplex)进行定量PcR检测。选取20“LPcR反应体系：1O灿2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代号DRR039A)，上下游引物各0．5灿(终浓度为10“m01／L)，探针0．5皿(终浓度为5“mol／L)，模板DNA2此，补充水至20此。PCR反应参数：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40个循环，每个样品重复4次，每批样品设置空白对照和阳性对照。空白对照用灭菌超纯水作模板，阳性对照用已知病原虾提取的DNA调整浓度后作模板。

1．2．5标准品的制备和标准曲线的建立阳性质粒标准品制备根据Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到纯化阳性质粒DNA，其浓度为1．618×108copy／此。用10倍稀释阳性质粒至7个梯度作模板并对其进行扩增，其平均CT值依次为34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，标准曲线如图l所示，R2=0．9991。

2结果与分析

2．1第一批放苗1～4池塘养殖全程对虾携带wSSv检测结果

2．1．114—34池塘对虾鳃组织中WSSV携带量在养殖全程中，14—3”池塘对虾鳃组织中wsSV携带量的动态变化如图2所示。从图中可以看出，3口池塘的对虾苗种均携带wssv，且其携带量均达到了103copy幢以上。随着养殖的进行，对虾鳃组织中wssV的携带量整体呈现波动上升的趋势。养殖前期上升幅度较小，最高携带量为1．o×105copy幢；到养殖60d左右，24、34池塘出现第一个波动高峰，此时鳃中wssV携带量最高可达到3．O×107c叩y／g。随后其病毒携带量有所下降；到养殖后期，1”一3“池塘的wssv携带量均有较大幅度的上升，均在养殖末期达到最大峰值。养殖全程中，14池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池对虾鳃组织wssV携带量的波动范围为1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。

2．1．21L3”池塘对虾肌肉组织中wsSv携带量在养殖全程中，1群一3j!j}池塘对虾肌肉组织中wssV携带量如图1所示，其动态变化情况与鳃组织中的趋势相似，均呈现波动上升的趋势，但整体低于鳃组织。结果显示，14养殖池对虾肌肉组织wssV携带量的波动范围为1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24养殖池对虾肌肉组织wssV携带量的波动范围为2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34养殖池对虾肌肉组织WssV携带量的波动范围为6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取对虾鳃和肌肉组织带毒量的平均值)，环境指标及养殖环境状况见表2。

2．2第二批放苗4L64池塘加密采样对虾携带WSSv的检测结果

2．2．14牝矿池塘对虾鳃组织wSSV携带量44—6“池塘对虾鳃组织WSSv携带量在养殖过程中的动态变化如图2所示。从图中可以看出，前期病毒携带量均较低，随着养殖的进行，3个池塘对虾鳃组织中wssv携带量逐渐升高，30d左右各池出现第一个波动高峰，wssV最高携带量为1．21×106copy／g，随后有所稳定和下降，但11月6日即养殖53d后，携带量快速增长。其中58池塘携带量在5天之内从2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最终暴发wss，导致中断养殖，最后一次采样缺失：44、64池对虾wSSV携带量在后两次采样中迅速增加，最后一次采样11月20日(即养殖63d)时均达到各池检测的最大值(分别为6×106copy／g和5×107c叩y／g)，虽未达到发病阈值但两池最终也因暴发wsS而于11月27—30日停止养殖。调查结果显示，在整个养殖过程中，48池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“养殖池对虾鳃组织wSsV携带量的波动范围为1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”养殖池对虾鳃组织wSsv携带量的波动范围为5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。

2．2．24L6”池塘对虾肌肉组织中WSSV携带量44—64池塘对虾肌肉组织wSSv携带量在养殖过程中的动态变化如图2所示，其变化情况与鳃组织的趋势相似，均随养殖时间的进行逐渐波动上升，且无显著性差异。调查结果显示，4”池对虾肌肉组织WSSV携带量的波动范围为8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池对虾肌肉组织wSsV携带量的波动范围为1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池对虾肌肉组织wSSv携带量的波动范围为5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取对虾鳃与肌肉组织带毒量的平均值)，环境指标及养殖环境状况见表3。3讨论TaqMan探针法荧光定量PcR是实时荧光定量PCR(Real．timePCR)的一种，可以针对微量的病毒进行检测并实时监测病毒的复制情况，其特异性更强，准确度更高，被广泛用于微量病毒复制的定量研究[7]。本研究采取实时定量PcR—TaqMan探针法，对高密度精养池塘对虾wssV携带量进行跟踪调查，以期能够更加准确的了解对虾养殖过程中体内wssv携带量的变化。本次检测结果表明，被测对虾苗种携带微量wSSV范围在1．3×103～1．7×104copy儋。虾苗携带病原体，说明了苗种生产过程中的病害控制还需加强，对育苗场销售的苗种病害监控还需严格【8J。整个检测结果表明，对虾鳃组织中的wssV携带量整体多于肌肉组织，且两者变动趋势一致，但没有显著性差异(尸>0．05)。在对14—3“池塘整个养殖过程的调查中，wssV携带量在养殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均处于一个较稳定的水平，wsSV拷贝数总体保持在104copy／g左右，个别值高于105copy／g；养殖中后期(60～116d)携带量呈现波动上升的趋势，并在最后一次采样中达到相对最大值。根据1“一34池塘中对虾体内wssv前期携带情况的调查，对第二批采样的4虻64号3口池塘进行密集采样，缩短了采样时间，增加了采样次数，以期更好的反应wssv的变化规律及其受各种环境因素影响所表现出的动态变化。在对4牝64池塘养殖的调查中发现，这3口池塘对虾携带wssV的情况与1L38池塘较为相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均处于一个较稳定的水平，除个别池塘外，wssv拷贝数多保持在105copy／g以下。然而53d后急剧上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，导致wSS暴发。44和64池塘也紧急收获，致使养殖中断。

探讨本次调查检测中发病池塘对虾wssv携带量急剧上升并率先暴发wss的原因，笔者发现，池塘水体中浮游微藻及水体温差变化大是主要原因。其中浮游微藻的种群结构不良是重要因素；冬棚搭建后造成水体温差变化大是主要诱因。有研究表明，良好的浮游微藻种群结构可以提高对虾养殖生态系统的稳定性，增强系统的抗干扰能力，有利于对虾健康安全的生长【9。1…。对虾疾病的暴发与水体中浮游微藻群落结构的变化具有一定的相关性，虾池中浮游微藻的种类和数量尤其是赤潮生物的类群和数量与对虾发病的程度呈正相关，其多样性指数与对虾的发病程度呈负相关【11-”J。由表2、表3可知，在对以上各池塘的养殖环境指标中浮游微藻种群结构的检测结果显示：2一、3僦塘养殖初期均以赤潮藻为优势种，在凡亚比台风过境后的1周左右，24、34池塘均出现大量死虾的情况，台风后的第一次采样，对虾体内的病毒含量也出现急剧的升高。4牝64池塘养殖前中期的浮游微藻种类单一，且均以颤藻为优势种，当池塘优势种由颤藻演替为其他藻类时，对虾带毒量均出现较大的波动。水温也是影响wSSV复制的重要因素之一【14，l6I，搭建冬棚前后，养殖水体在短时间内的最大温差可达7℃，由原来的20℃左右升高到26℃左右，达到病毒复制的最佳温度范围。搭建冬棚后的采样与之前采样相比带毒量有较大幅度的升高。所以笔者认为，当池塘浮游微藻群落结构长期不良，尤其是以颤藻等赤潮藻长期作为优势种时，会致使对虾免疫系统受到影响，使对虾一直处于亚健康状态，间接促进了wssV在体内的复制，而环境因素改变如水温在适宜病毒复制的温度范围或冬棚的搭建使水温在短时间内变化较大。使得对虾产生应激反应，抵抗力有所下降，从而诱发了病害的发生。

综上所述，笔者认为，对虾可以在携带wSSV的情况下养殖生长，并成功上市，但前提是一个良好的养殖生态环境的构建和保持。降低或控制wssV的含量，使其低于发病阈值。影响wssV复制或暴发的关键因素有以下几点：①对虾免疫力的下降；②环境因子不稳定和恶化，如盐度突变，温度突变或者长期处于病毒最佳复制温度25～28℃之间、pH突变、氨氮和亚硝酸盐浓度突变或长期处于高值范围[15-161；③池塘水体中浮游微藻和细菌的群落结构不良[17]等。④对虾养殖前中期是各种对虾病暴发的关键时期，更应注重对这些养殖时期对虾抵抗力的增强。鉴于此，有效预防wSS病毒病的关键点在于生态防控：①构建优良的藻相，为对虾生长提供适宜的环境，增强对虾抵抗力，同时也可以减少不良藻相分泌的藻毒素等有害物质对对虾的伤害；②定期投放微生态制剂改良养殖生态环境，如益生菌中芽孢杆菌的施放，有效调节池塘环境，利于对虾生长[18_191；③针对台风暴雨等天气，要提前积极做好预防工作，缓解台风暴雨给虾体和养殖环境带来的不良影响，如台风暴雨前后加强投放微生态制剂，维持良好浮游微藻和细菌的群落结构；④提高对虾自身免疫力，如在饲料中增加Vc、葡聚糖和中草药等物质‘201；⑤采用混养模式‘211，增加捕食性动物，如少量混养罗非鱼、石斑鱼和虾虎鱼等凶猛鱼类，可以捕食病弱对虾，减少对虾因残食而导致的病害水平传播。总之，笔者认为应对wss，防大于治，在本调查的结果中发现并总结，在高位池对虾养殖环境中，藻相的优劣直接或间接的影响着对虾抵抗力的高低，同时反映了对虾抗病能力的强弱。构建良好的浮游微藻和细菌的群落结构，保持养殖水体环境稳定，可以最大程度的减少WSS暴发。