电针对慢性坐骨神经压迫性损伤大鼠神经病理学及背根神经节P2X3受体表达的影响
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摘 要：目的：观察EA对CCI大鼠坐骨神经组织病理学及DRG P2X3受体表达的影响，探讨电针对神经组织学的影响及P2X3受体在电针镇痛效应中的作用。方法：将32只成年雄性SD大鼠，分为假模组、模型对照组、健侧EA组、患侧EA组，每组8只，模型对照组及EA组结扎坐骨神经造成CCI疼痛模型。各组于术前（0天）及术后3、5、7、10、12、14天分别测量大鼠患侧足MWT和TWL，EA组于术后第8天电针“足三里”-“阳陵泉”连续7天，每天1次。术后14天对坐骨神经标本行组织学观察，采用Estebe 评分方法行组织学评分，免疫荧光组织化学检测患侧L5背根神经节中p2x3受体的表达情况。结果：与术前比较，CCI各组大鼠痛阈明显降低，出现痛觉过敏（P
关键词：电针；慢性坐骨神经压迫性损伤；神经病理学；背根神经节；P2X3受体；镇痛
中图分类号：R245.97 文献标识码：B 文章编号：1673-7717(2012)01-0066-04
Effect of Electroacupuncture on Neurotoxicologic Screening of Sciatic Nerve And Expression of P2X3 Receptor in Dorsal Root Ganglion of Rats with Chronic Constrictive Injury
CHENG Ruidong, TU Wenzhan, CAO Fen, CHENG Bo, JIANG Songhe
(Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325027, Zhejiang,China)
Abstract:Objective: To observe the effect of EA on neurotoxicologic screening of sciatic nerve and the expression of P2X3 receptor in the DRG of rats withCCI, so as to screen the neurotoxicological effect on sciatic nerve and to determine the role of P2X3 receptor in EA analgesia.Method: A total of 32 SD rats were randomly divided into 4 groups:Sham-CCI group, CCI model group, healthy limb EA group and affected limb EA group, with 8 cases in each group. The TWL and MWT were measured before CCI operation and at days3, 5, 7, 10, 12 and 14 after CCI operation. EA began at day 7 after CCI operation and then resumed once daily until the rats were killed at day 14 after the last EA treatment. EA was respectively applied to Zusanli acupoint (ST36) and Yanglingquan acupoint (GB34). The sciatic nerve samples were obtained for neuropathological examination under light microscope.The expression of P2X3 receptor in the L5 DRG of rats was detected by means of immunofluorescence techniques.Result: In the CCI group, the pain thresholds were decreased obviously compared with before CCI operation（P
Key words:electroacupuncture; chronic constrictive injury; neurotoxicologic screening；dorsal root ganglion; P2X3 receptor; analgesia
电针（electroacupuncture，EA）是在传统针刺刺激腧穴的基础上，叠加多种频率、模式的脉冲电流，以加强刺激、增强疗效的现代针灸疗法，已被广泛应运用于临床治疗中，尤其镇痛效果较好而常用于疼痛性疾病[1]。神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统的损伤和功能紊乱引起的慢性疼痛[2]，不仅对机体有害，而且持续时间长，常导致患者生活质量降低。电针在神经病理性疼痛上具有显著的镇痛作用，而ATP及其P2X3受体在伤害性信息的传递中具有重要的作用，研究显示P2X3受体参与了神经病理性痛[3]。本实验通过电针干预CCI模型大鼠，观察坐骨神经组织学的改变及P2X3受体在DRG神经元中表达的变化，旨在为进一步研究及临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
32只成年清洁级雄性SD大鼠（由温州医学院实验动物中心提供），体重150~180g，随机分为假模组、 模型对照组、健侧EA组、患侧EA组，每组8只，其中假模组仅暴露坐骨神经，其余3组造成坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constrictive injury , CCI）疼痛模型。
1.2 模型制备
建立大鼠CCI模型，5％水合氯醛（0.6mL/100g）腹腔注射麻醉；固定后大鼠右侧后肢去毛备皮，常规消毒，沿右股骨切开皮肤，钝性分离肌肉；暴露坐骨神经，用4-0号铬制羊肠线在坐骨神经分叉前打4次松结，间隔1mm使神经外膜稍稍受压，松紧度以大腿肌肉或足指轻微抽动，不影响神经外膜的血运为度，不可过紧；分别缝合肌肉和皮肤，表面清洁消毒，包扎，放回鼠笼饲养。其中假模组仅暴露坐骨神经2~3min，不打结，其余手术操作相同。
1.3 痛阈测定
1.3.1 足机械足反射阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT） 的测定 于术前（0天）及术后3、5、7、10、12、14天，采用2450型爪痛觉测试仪测定各组大鼠MWT值，于安静大鼠右前足底加压至逃避性抬腿或右后肢抽动，记录抬腿时施加于大鼠足底的最大力度（g），重复6次，间隔5min，去掉最大值和最小值后取平均值。
1.3.2 热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency , TWL） 于术前（0天）及术后3、5、7、10、12、14天，采用37370型爪热觉测试仪测定各组大鼠TWL 值。仪器发射红外光照射大鼠右后爪足底，安静大鼠逃避性抬腿时，仪器自动感应切断热源记录开始照射至出现缩足逃避反射时间（s），重复5次，间隔10～15min，去掉最大值和最小值后取平均值，红外光照射截止时间为40s，以防大鼠足底灼伤。
1.4 电针干预方法
将大鼠适度固定于自制改良的大鼠针刺固定器（专利申请号：201110021482.5），相应部位剪毛备皮，安静后用3mm皮内针针刺“足三里”-“阳陵泉”穴，垂直进针2～3mm 。采用韩氏电针治疗仪，2mA，2/100Hz交替波脉冲电流连续刺激（以腿部肌肉轻微抽动为度），每日1次（每日固定时间），每次持续30min，连续干预7天。假模组和CCI模型对照组不予以电针处理。
1.5 取材、灌注固定和组织切片
术后第14天电针干预及测定痛阈后，10％水合氯醛（0.4mL/100g体重）腹腔注射深度麻醉。开胸，经左心室插管行心脏灌注固定，先快速灌注温生理盐水100mL，再灌注4％的多聚甲醛磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)(0.1 mol／L，pH值7.2～7.4)200mL。1h后及时取右侧L5背根神经节（dorsal root ganglion , DRG）及结扎处以下长约5mm坐骨神经，置4％的多聚甲醛PBS液内后固定，石蜡包埋，每块组织连续切片，用于组织学观察及免疫荧光组化检测。
1.6 组织学观察及免疫荧光组织化学检测
1.6.1 坐骨神经组织切片 经HE染色，光镜下观察。根据Estebe等[4]评分方法行坐骨神经组织学分级评分。由同一病理科医师阅片，将每组大鼠的坐骨神经病理组组织学评分进行累加。
1.6.2L5 DRG组织切片 64℃烤1h，脱腊，抗原修复，3％H2O2孵育10min以灭活内源性过氧化物酶化酶；滴加封闭液，37℃孵育1h；滴加稀释的P2X3一抗（1：500）覆盖标本，37℃孵育1h；0.1%TBSTs洗涤液冲洗；去除洗涤液，滴加稀释的荧光标记二抗（1：1000）覆盖标本，避光孵育1h；0.1%TBSTs洗涤液冲洗；滴加抗荧光淬灭封片液覆盖标本，封片，显微镜下观察。
1.7 统计学分析
所得数据均用平均值±标准差（±s）表示，所有数据经SPSS统计软件16.0版本处理，组间差异分析采用单因素方差分析，后进行LSD检验，P
2 结 果
2.1 模型成功的鉴定
CCI模型制备后大鼠出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象，表明坐骨神经慢性压迫性损伤模型制备成功。
2.2 行为学观察
2.2.1 大鼠患侧足机械足反射阈值（MWT）
假模组大鼠MWT值术后第3天降低，与术前相比差异均有统计学意义（P0.05）。模型对照组大鼠MWT值术后第3天明显降低，与术前相比差异均有显著统计学意义（P
2.2.2 大鼠患侧足热缩足反射潜伏期（TWL） 假模组大鼠TWL值术后第3天降低，与术前相比差异均有统计学意
义（P0.05）。模型对照组大鼠TWL值术后第3天明显降低，与术前相比差异均有显著统计学意义（P
2.3 组织学观察
各组镜下可见坐骨神经的神经外膜完整，轴索排列大致整齐，少量炎性细胞浸润（插页Ⅱ图1a）。神经束膜基本完整，轴索排列大致整齐，无明显脱髓鞘改变（插页Ⅱ图1b）。各组坐骨神经组织学评分均为2分，差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 免疫荧光组织化学结果
阳性结果为胞浆呈强绿色荧光，P2X3免疫阳性主要定位于DRG中、小型神经元胞浆，胞核不显色，大细胞及周围神经纤维呈微弱荧光反应。模型对照组P2X3蛋白阳性神经元总数明显高于假模组，差异有显著统计学意义（P
3 讨 论
目前国内外对电针治疗神经病理性疼痛原理的神经、神经化学及分子机制进行大量研究，嘌呤类物质及其受体在电针镇痛效应中的作用引起广泛关注，其中ATP已被确定为神经系统的一种递质或调质，其受体P2X3受体广泛分布于中枢及外周神经系统。以往的研究证实ATP在伤害性信息的传递中具有重要的作用[5]，而通过对其受体P2X3受体基因敲除、鞘内注射P2X3受体反义寡核苷酸和鞘内P2X3受体特异性拮抗剂A-317491等方法证实P2X3受体在痛觉中发挥重要作用[6-7]。以往的大量研究基本证实了针刺信号传入的神经通路[8]，而这与P2X3受体的主要分布区域相吻合[9]。Geoffrey Burnstock[10]分析大量临床及实验研究，提出嘌呤类物质及其受体参与电针镇痛的假说。Nanna Goldman等[11]在“足三里”穴通过微量透析的方法收集针刺前、针刺过程中及针刺后的细胞外液，通过高效液相色谱法检测针刺穴位周围嘌呤类物质的浓度。证实针刺位周围ATP浓度明显增高，由此推断大量嘌呤类物质的瞬间释放会激活穴位附近的效应细胞如神经末梢上的相应受体，完成针刺信号的转换和起始传递过程；然后，通过一系列生理改变，激活最终的效应细胞，达到镇痛的目的[12]。本实验发现电针前后CCI大鼠MWT和TWL差值明显增加，表明电针对大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤所致疼痛有明显的镇痛作用，与以往的研究结果吻合。通过对假模型组、模型对照组及电针前后、大鼠坐骨神经非损伤部位的病理组织学的观察及评分未见明显性差异，表明本实验中，造模本身对非损伤段坐骨神经的病理组织无明显影响，电针前后也未见改变。
Novakovic等[13]发现CCI大鼠对应节段DRG中、小型神经元P2X3受体表达显著增加。可能机制为大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤后，DRG神经元受到损害，ATP被从胞内大量释放，负反馈调控式的嘌呤能级联反应对ATP的调控作用失控，致使ATP在胞外聚集，作用于P2X3受体兴奋初级传人神经纤维，传递伤害性痛觉信息；这些变化激发神经元P2X3受体产生代偿性表达[14]。那么电针是否会影响CCI大鼠DRG中P2X3受体的表达？本实验通过免疫荧光组织化学检测CCI大鼠L4-6 DRG中P2X3受体的表达，结果显示DRG中、小型阳性神经元数量明显增加；P2X3受体主要表达在DRG的中、小直径神经元上，与以往报道相一致；而电针组DRG中、小型阳性神经元数量较CCI模型对照组明显减少，但多于假模组。本实验中健侧与患侧电针对DRG中P2X3受体的表达无显著性差异，这说明双侧电针信号均可以抑制大鼠CCI后P2X3受体的表达，从而产生镇痛的效应。阮怀珍等[15]通过应用全细胞膜片钳技术研究发现CCI大鼠P2X3受体对其特异性激动剂ATP的反应敏感性增强，存在神经病理性疼痛时P2X3受体功能发生变化。Ou S等[16]Zhang AX等[17]的研究也证实了CCI大鼠P2X3受体对同一浓度的ATP及α,β-meATP反应敏感性增强。但电针信号是否会对P2X3受体的功能产生影响，降低P2X3受体对其特异性激动剂的反应敏感性，有待相关电生理实验的进一步验证。
总之，本实验的结果显示电针可以提高神经病理性痛大鼠的痛阈，降低与产生疼痛相关的P2X3受体的表达以起到镇痛的效应。
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