雾化吸入布地奈德对肺纤维化大鼠肺组织MMP?2、TIMP?2表达的影响
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作者：张小波 ，范贤明，王文军，湛晓琴，曾鸣，朱晨
【摘要】 目的 探讨布地奈德雾化吸入对博莱霉素(blm)致肺纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶?2（mmp?2）及金属蛋白酶抑制剂?2（timp?2）表达的影响。方法 wistar大鼠45只，随机分成博莱霉素模型组(blm组)、生理盐水空白对照组(ns组)和布地奈德干预组（bud组）各15只，blm组和bud组气管内灌注博莱霉素诱导肺纤维化，ns组在相同条件下灌注生理盐水。气管内灌注药物后，第0～6天bud组给予布地奈德雾化吸入，其余组在相同条件下给予生理盐水雾化吸入。各组分别于第7、14、28天随机处死5只，收集肺组织作切片、行he及masson染色，判断肺组织肺泡炎及肺纤维化程度；行免疫组化染色，检测mmp?2和timp?2在肺组织的表达水平。结果 与ns组相比，bud组第7、14、28天肺组织的肺泡炎和肺纤维化程度明显加重（p<0.5）；与blm组相比，bud组第7、14天肺组织的肺泡炎程度明显减轻(p<0.05)，第7、14、28天肺纤维化程度明显减轻(p<0.05)；与ns组相比，blm组第7、14、28天mmp?2和timp?2表达明显增加（p<0.5）；与blm组相比，bud组第7、14、28天mmp?2和timp?2表达明显降低 (p<0.05)。结论 布地奈德雾化吸入可减轻blm致肺纤维化大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度，其干预机制可能为降低肺组织内mmp?2及timp?2的表达，并在一定程度上调整mmp?2/timp2的比值。
【关键词】 布地奈德；肺纤维化；博莱霉素；基质金属蛋白酶?2（mmp?2）；金属蛋白酶抑制剂?2（timp?2）
the effect of inhaled budesonide on the expression mmp?2 and timp?2 in lung tissues of rats with pulmonary fibrosis
zhang xiaobo, fan xianming, wang wenjun, zhan xiaoqin, zeng ming, zhu chen, the attached hospital to luzhou medical college, luzhou, sichuan province 646000
abstract objective to investigate the effect of inhaled budesonide on the expression of matix metalloproteinases?2（mmp?2） and tissue inhibitors of metalloproteinases ?2 (timp?2) in lung tissues of rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis. methods 45 wistar rats were randomly divided into 3 groups: the bleomycin (blm) group, the budesonide (bud) group and the normal solution (ns) group. intratracheal perfusion of blm was made to the bud group and the blm group to induce pulmonary fibrosis while perfusion of normal solution to the ns group in the same condition. from 0 to 6 days after perfusion, aerosol inhalation of bud was given to the bud group but normal saline to other groups in the same condition. on the 7th, 14th, and 28th day, the rats were killed, 5 rats from each group each time, and the lung tissues were sectioned which were dyed by he and masson to determine the extent of alveolitis and pulmonary fibrosis, and then the expression levels of mmp?2 and timp?2 in lung tissues were detected. results on the 7th, 14th, and 28th day, the extent of alveolitis and pulmonary fibrosis of the bud group were much higher than those of the ns group (p＜0.5) but much lower than those of the blm group (0.05); on the 7th, 14th, and 28th day, the expression levels of mmp?2 and timp?2 in the blm group were much higher than those in the ns group (p＜0.5) while the levels in the bud group were much lower than those in the blm group (p＜0.05). conclusions the aerosol inhalation of budesonide can meliorate the extent of bleomycin-induced alveolitis and pulmonary fibrosis in lung tissues of the rats, the intervention mechanism is probably contributed to the reduction of the expression levels of mmp?2 and timp?2 in lung tissues and the regulation of the ratio of mmp?2 and timp?2 to some extent.
keywords budesonide pulmonary fibrosis bleomycin matix metalloproteinases?2（mmp?2） metalloproteinases ?2 (timp?2)
肺间质纤维化是许多慢性肺部疾病的终末病理过程，其发病率在全球呈上升趋势，其实质就是某些病理因素诱发肺损伤持续进行，继而导致细胞外基质（extracellular matrix ,ecm）代谢紊乱，某些细胞外基质成份在肺泡和间质内沉积，以及纤维组织过度修复造成肺组织结构紊乱。启动和调节肺损伤和持续过度修复的信号传导过程目前仍不清楚。近年来研究表明，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,mmps）及其组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases,timps）在肺损伤和修复，以及肺纤维化的形成过程中起重要的调节作用。本实验采用博莱霉素(b1eomycin，blm)对大鼠单次气管内灌注的方法，复制出大鼠肺纤维化模型，通过该模型了解布地奈德雾化吸入对肺组织中mmp?2及timp?2表达的影响，初步探讨其干预肺纤维化的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 清洁级健康雌性wistar大鼠，体重180～200g左右（泸州医学院实验动物中心提供）；博莱霉素a5（天津太河制药有限公司）；布地奈德(阿斯利康制药有限公司，1 mg／支)。mmp?2和timp?2免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；免抗鼠mmp?2 多克隆抗体购自武汉博士德公司；兔抗鼠timp?2 多克隆抗体购自武汉博士德公司。
1.2 肺纤维化模型的建立 wistar大鼠45只，实验条件下饲养1周，随机分成布地奈德干预组（bud组）、博莱霉素模型组（blm组）和生理盐水空白对照组（ns组），每组15只。bud组和blm组大鼠用氯胺酮（100mg/kg体重）麻醉后，在无菌操作下行气管切开，以两气管软骨环的间隙为穿刺点，朝向心端刺入气管，将含blma5(5mg／kg体重)的生理盐水0.2～0.3ml注入气管，旋转动物，使药液均匀分布在肺内。ns组大鼠同等条件下气管内灌注生理盐水。气管内灌注药物后，第0～6天每天雾化1次，bud组给予布地奈德雾化吸入（ 0.5mg／kg体重)，ns组和blm组在同等条件下雾化吸入等量生理盐水。第7、14、28天每组采用右室采血的方法各随机处死5只大鼠。
1.3 肺组织标本的留取和组织学分析 右心室采血处死动物后，经右心室注入4℃生理盐水冲洗双肺至肺脏呈苍白胶冻样，向左肺支气管内注入4％的多聚甲醛，将左肺组织放入4％的多聚甲醛中固定24小时。在不同部位取材3块，常规石蜡包埋，切片，行he染色观察肺泡炎、行masson染色观察肺纤维化程度，参照文献［1］进行肺泡炎和肺纤维化程度评分。
1.4 肺组织mmp?2和timp?2免疫组化染色测定 免疫组化染色按照s?p试剂盒的说明操作，其中第一抗体分别为免抗鼠mmp?2多克隆抗体（效价 1：100）和兔抗鼠timp?2 多克隆抗体(效价1：100)，加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液后，用二氨基联苯胺(dab)／h 2o2显色，常规脱水、透明、中性树脂封固。同时以pbs代替第一抗体，设立阴性对照实验。阳性表达为胞质内呈棕黄色颗粒改变。
染色结果分析：以图文分析软件image-pro plus5.1采集肺组织免疫组化染色图像，随机取5个高倍视野(×400)，测量每个视野阳性染色的平均积分光密度值(iod值)，以反映各组肺组织中mmp?2及timp?2表达的变化。
1.5 统计学分析 数据用均数±标准差(±s)表示，采用spss13.0统计软件进行统计学处理，样本均数的比较采用单因素方差分析和q检验，检验水准α=0.05，如果p＜0.05，则认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理学改变 ns组肺组织结构正常；blm组第7天时表现为肺泡炎及肺间质炎症，第14天时肺泡炎仍较重，但肺间质开始出现纤维化改变，肺泡结构出现紊乱，第28天时肺间质广泛纤维化，肺泡结构难以分清。而bud组第7、14 、28天的肺泡炎和肺纤维化程度与blm组相比明显减轻。见表1和表2。
表1 布地奈德对肺纤维化大鼠肺泡炎症程度的影响（略）
注：*与ns组比较，p<0.05；δ与blm组比较，p<0.05
表2 布地奈德对肺纤维化大鼠肺纤维化程度的影响（略）
注：*与ns组比较，p<0.05；δ与blm组比较，p<0.05
2.2 肺组织mmp?2的表达 ns组肺组织中，血管内皮细胞、部分支气管上皮细胞胞质内mmp?2呈极弱阳性，blm组肺组织中，第7天病灶处上述各种细胞阳性着色均较ns组强，其中以肺间质内间质细胞及肺泡间隔和肺泡腔内的巨噬细胞阳性表达尤为明显；第14天时，表达继续增强；第28天时，各种阳性表达仍较高，但和第14天相比，阳性表达已减弱。bud组肺组织中第7天、第14天及第28天细胞阳性表达均较空白组高，但与blm组相比，着色减弱。blm组与ns组相比，差异有统计学意义（p<0.05），bud组和blm组相比，差异有统计学意义（p<0.05），见表3。第28天时，mmp?2在ns组、bud组和blm组中的表达分别见图1-3。
表3 免疫组化染色检测mmp?2在各组肺组织中的表达（略）
注：*与ns组比较，p<0.05；δ与blm组比较，p<0.05
图1 ns组肺组织第28天免疫组化染色，mmp?2阳性表达极弱 ，spa法 ×400（略）
图2 blm组肺组织第28天免疫组化染色，mmp?2阳性表达较强，spa法 ×400（略）
图3 bud组肺组织第28天免疫组化染色，mmp?2阳性表达弱于blm组，spa法 ×400（略）
2.3 肺组织timp?2的表达 ns组肺组织中，timp?2在肺泡及间质巨噬细胞、肺泡上皮、支气管上皮细胞、成纤维细胞阳性表达均极弱。bud组肺组织第7天后，上述部位细胞阳性表达有所增强，第14天时，表达继续增强；第28天时，表达仍继续增强。bud组的大鼠肺组织第7天、第14天及第28天细胞阳性表达均较ns组高，但与blm组相比，表达减弱。blm组与ns组相比，差异有统计学意义（p<0.05），bud组和blm组相比，差异有统计学意义（p<0.05），见表4。第28天时，timp?2在ns组、bud组和blm组中的表达分别见图4-6。
表4 免疫组化染色检测timp?2在各组肺组织中的表达（略）
注：*与ns组比较，p<0.05；δ与blm组比较，p<0.05
图4 ns组肺组织第28天免疫组化染色，timp?2阳性表达极弱，spa法 ×400（略）
图5 blm组肺组织第28天免疫组化染色，timp?2阳性表达较强，spa法 ×400（略）
图6 bud组肺组织第28天免疫组化染色，timp?2阳性表达弱于blm组，spa法 ×400（略）
3 讨论
目前肺间质纤维化的发病机制仍不十分明确，其早期病理改变为肺泡炎症导致的肺持续损伤，晚期为细胞外基质（extracellur matrix ,ecm）的反复破坏、修复、重建及过度沉积。近年的研究表明，肺间质纤维化与基质金属蛋白酶（mmps）和金属蛋白酶组织抑制剂（timps）的关系非常密切［2］，这为肺纤维化的研究提供了一个新的突破口。mmps是上世纪90年现的一类含锌的蛋白水解酶，其主要作用是降解细胞外基质。timps是mmps的特异性抑制剂，与mmps特异性结合，并使之失活，直接参与细胞外基质的代谢。研究证实，mmps与timps的过高表达，以及mmps/timps的比例失衡是肺纤维化发生及发展的关键。在肺纤维化的初期，即肺泡炎阶段，mmps表达增加，其降解作用增强，造成肺组织的损伤，但timps的表达也增加，mmps/timps的比例仍能维持平衡，这可能是炎症早期未出现ecm积聚的重要原因；在后期即纤维化阶段，mmps表达减少而timp表达增高，mmps／timps比例下降，其降解作用减弱，基质沉积增强，形成肺纤维化［3～4］。在肺纤维化的形成过程中， mmps和timps家族中的所有成员并非同等重要，研究证实，mmp?2和timp?2的过高表达，mmp?2/timps的比例失衡是肺纤维化发生和发展的关键［5～6］。mmp?2即明胶酶a，它的主要作用底物是弹性蛋白、纤维粘连蛋白和ⅳ型胶原等，timp?2是mmp?2的的抑制剂，它与活化的mmp?2以1：1的形式形成复合体，从而抑制其活性，另外，在mt1?mmp激活mmp?2的过程中也需少量的timp?2，以加速激活过程。本实验中，我们选择模型的肺泡炎高峰期(第7天)、肺纤维化形成期（第14天）和稳定期(第28天)作为观察点，结果发现，blm组第7天mmp?2表达增强，第14天表达继续增强，到第28天时，和第14天时相比，表达已有减弱。 timp?2第7天、第14天表达增强，到第28天时仍持续增强，mmp?2/timp2的比例下降，这与研究结果相符合。
基于mmps及timps在肺纤维化病理过程中的重要作用，降低它们的过高表达，以及寻求它们之间的平衡已成为干预肺纤维化形成的途径之一。国外已有学者［7］运用mmps抑制剂batimastat治疗博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠，结果表明，动物注射batimastat后肺纤维化程度明显减弱。本实验中我们选择干预的药物为布地奈德，它具有较强的局部抗炎作用，能抑制多种细胞因子如白介素?1（il?1）、肿瘤坏死因子（tnf?a）、表皮生长因子（egf）等的产生。fleenor、hosseini等［8，9］研究认为，细胞因子如il?1a、tnf?a、egf等均可提高mmps的表达。此外，布地奈德脂溶性强，与激素受体亲和力强，不易被11β羟基类固醇脱氢酶破坏，它的半衰期短，体内灭活快，能通过雾化器将药物颗粒直接送入肺泡腔内，直接作用于肺泡上皮，而不需经过毛细血管渗透，且用药剂量较少，可长期应用而不至于产生严重的全身副反应，如骨质疏松、高血糖、肥胖等［10，11］。我们的实验表明，从纤维化评分来看，bud组在第7天、14天和第28天均比blm组轻；从肺泡炎评分来看，bud组在第7天和第14天肺泡炎程度较blm组轻，但在第28天两者差别不明显，从mmp?2和timp?2的表达来看，bud组第7天、14天和第28天均较blm组低。其作用机制可能是这一时期布地奈德表现出强烈的抗炎作用，抑制了il?1、tnf?a、egf等细胞因子的产生，从而抑制了mmp?2的表达，布地奈德对炎症时细胞因子的抑制，同样也抑制了timp?2的合成和活化，从而抑制了timp?2的表达。另外，在我们的实验中， bud组第28天时mmp?2的降低已不如第7天时明显，与blm组相比，mmp?2/timp2的比值出现升高。因此，我们认为布地奈德对肺纤维化的干预作用可能是它能在各个时段降低mmp?2和timp?2的表达，并调整mmps／timps的比值，延缓甚至抑制肺纤维化的进程。
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