禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法
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摘要：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）是一种双链DNA病毒，病毒对外界环境耐受较强，并有水平传播及垂直传播两种传播方式，近年来在国内呈暴发式流行，各地养殖场均有报道检测到FAV-Ⅰ，FAV-Ⅰ对养殖业造成严重损失。分离、鉴定FAV-Ⅰ的毒株类型是防控此病的基础。除传统的检测方法外，近年新兴了多种检测技术，对这些分离、鉴定方法进行了概述。
关键词：禽腺病毒Ⅰ群；分离；鉴定
中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）02-0005-03
近年来禽腺病毒病在我国发病率日益升高，给养殖业造成巨大损失。感染禽腺病毒的家禽21 d内死亡率高达30%，禽腺病毒病的防治成为迫要需要解决的问题[1]。禽腺病毒是一种DNA病毒，能够引起鸡群禽腺病毒感染，是一种亚临床性传染病，感染鸡群通常为症状不明显的隐性感染，并长期带毒[2]。根据病毒群特异性抗原的不同将其分为三群：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）、禽腺病毒Ⅱ群、禽腺病毒Ⅲ群。FAV-Ⅰ主要包括传统的腺病毒以及从其他禽类分离出的腺病毒分离株，这些腺病毒毒株具有相同的抗原群；禽腺病毒Ⅱ群主要是包括火鸡出血性肠炎及鸡大脾病毒，这些病毒具有和FAV-Ⅰ不同的抗原群；禽腺病毒Ⅲ群主要是产蛋综合征相关的病毒。
据报道FAV-Ⅰ能引起心包涵体炎、心包积水-肝炎综合征等传染病[3]。FAV-Ⅰ病毒可分为A、B、C、D、E、F五个种和12个血清型[4]。禽腺病毒的潜伏期较短，鸡日龄越小越易感染FAV-Ⅰ，成年鸡也可感染，通常没有明显症状但是能够作为混合感染时的条件性病原，在一定条件下部分禽腺病毒也能够作为原发性病原，引发禽类的多种病症[5]。禽腺病毒能够通过鸡的排泄物排出，正常鸡接触后极易感染，并且禽腺病毒还能通过蛋垂直传播。报道称FAV-Ⅰ对宿主具有高度的特异性，只有少数的病毒能够感染宿主以外的动物。FAV-Ⅰ对外界环境的耐受较强，在室温中依然能够维持毒价长达半年，对酸和热的耐受也很强，因此其经过动物胃肠道依然可以保持活性，这使得其危害更加严重[6-7]。因此FAV-Ⅰ病毒群的分离、鉴定更具有指导意义，本文对常用的FAV-Ⅰ分离、鉴定方法进行了概述。
1 分离方法
禽腺病毒的分离通常是通过接种SPF鸡胚来分离、增殖。接种位置有两种，分别是卵黄囊接种及绒毛尿囊膜接种，接种鸡胚后病变主要出现在肝脏部位，肝脏呈重度充血、出血及严重的弥漫性变性、坏死。卵黄囊、肾脏、脾脏也有一定的变性、坏死[8]。
1.1 病料直接分离法
无菌操作取发病鸡肝脏，按照1∶5（W/V）的比例加入灭菌后的生理盐水，于操作台中研磨，生理盐水中预先加入双抗（青霉素2 000 U/mL；链霉素2 000 μg/mL）。充分研磨后，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min后取上清液，经0.22 μm的滤器过滤除菌，过滤液经无菌检验后，卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每日照蛋两次，弃掉3 d内死掉的鸡胚，收获4～10 d死亡的鸡胚的尿囊液，盲传检验所收获病毒液，合格后冷冻保存。
1.2 棉拭子分离法
取病鸡口腔及拭子，用适量的生理盐水浸泡拭子2 h，充分浸泡棉拭子后，反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清液经0.22 μm滤器除菌，经无菌检验后卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每日照蛋两次，弃掉3 d内死掉的鸡胚，收获4～10 d死亡的鸡胚的尿囊液，盲传检验所收获病毒液，合格后冷冻保存。
2 鉴定方法
禽腺病毒的鉴定方法有很多种，分别为免疫琼脂扩散试验、中和试验、电子显微镜法、PCR反应鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定、环介导的等温扩增技术（LAMP）、交叉引物扩增技术（CPA）等，每种方法都有其优缺点，根据实际要求选择合适的方法进行鉴定，现对其中几种实验室常用方法进行概述。
2.1 免疫琼脂扩散试验
根据沉淀试验原理，抗原、抗体在琼脂中扩散，相遇后可结合形成抗原-抗体复合物，外观呈一条白色沉淀线。应用免疫琼脂扩散试验鉴定FAV-Ⅰ病毒是一种血清学诊断技术，该方法具有操作简便、快捷、灵敏度高等特点，将病毒分离、纯化，用作免疫琼脂扩散试验的抗原，称取一定量的琼脂粉，按照1%浓度加入生理盐水，加热充分溶解，将溶解的琼脂溶液倒入平皿中，冷却，选择合适打孔器进行打孔，挑出孔内琼脂，小心加热平皿底部使孔底琼脂融化少许，起到封底的作用。加入阳性血清和所制备的抗原，倒置放置在湿盘中，37 ℃自由扩散24～48 h观察结果，看是否观察到白线，如果有则证明此抗原是FAV-Ⅰ[9]。
2.2 电镜检测鉴定
根据腺病毒的特征形态，该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称、直径约为80 nm。可以直接用电子显微镜观察病毒形态，看是否吻合进行初步确定。也有报道称禽腺病毒可以用电镜负染法鉴定，用适量的水重悬病毒粒子，在载玻片上以1%磷钨酸负染30 s，包埋于200目聚乙烯醇缩甲醛铜网上，用电子显微镜观察病毒粒子形态，看是否与禽腺病毒吻合[10]。
2.3 PCR方法鉴定
FAV-Ⅰ能够在细胞核内复制，产生嗜碱性包涵体，其结构蛋白主要是Hexon蛋白，含有特异性抗原决定簇，能够中和抗体，是病毒的一种保护基因，与病毒的致病性密切相关[11]。FAV-Ⅰ病毒有12个血清型，其中最具有代表性的病毒为鸡胚致死孤儿病毒（CELOV），许多学者应用PCR鉴定时会选择Hexon基因或CELOV的序列进行引物设计[12]。也有报道根据Hexon loop1基因及特意纤维蛋白原基因的同源性分析，可以将不同种的腺病毒进行进一步的分离鉴定，分析各种毒株的亲缘性关系，对疾病的防控起到了积极作用[13]。
PCR方法b定是常用的检测手段，根据GenBank中公布的病毒的全基因组序列的保守区设计引物。无菌取病鸡内脏研磨，将研磨液8 000 r/min离心后取上清液，提取其中的病毒DNA作为模板，加入酶、引物等。琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。用琼脂凝胶回收试剂盒将目的条带回收纯化，测序。将测序结果用NCBI中的Nuclear acid blasting进行序列比对，确定是否为FAV-Ⅰ感染[14]。
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