湖北省蛋鸡I群禽腺病毒感染的病例诊断

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摘要：2015年10月，湖北省某规模化鸡场产蛋鸡群相继发生某种疾病，日死亡率达2%。为了明确患病蛋鸡死亡的原因及确定病原，对临床送检患病蛋鸡开展了病理解剖、组织病理学观察、PCR检测和病毒分离等实验室诊断。结果表明，患病蛋鸡临床剖检可见心包内有淡黄色清亮液体，肝脏肿胀、脂肪变性和变色，肾脏肿大、尿酸盐沉淀较多；病理组织学观察发现肝细胞核内形成嗜碱性核内包涵体；病料样品及病料鸡胚接种尿囊液，PCR扩增产物测序结果与I群禽腺病毒hexon基因同源性为99%，表明分离到的病毒为I群禽腺病毒。

关键词：湖北省；蛋鸡；I群禽腺病毒；感染；诊断

中图分类号：S852.659 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）12-2310-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.12.027

Diagnostic of Fowl Adenovirus-I Infection in Layer in Hubei Province

GUO Jie，CUI Wei-tao，XU Qing-rong，HU Xue-ying，XIAO Yun-cai，

WANG Xi-liang，BI Ding-ren，LI Zi-li，ZHOU Zu-tao

（College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：In October 2015，layers inthe large-scale chicken farms had occurred some kinds of disease in Hubei province，daily mortality rate up to 2%. In order to define the cause of death and pathogen of the sick laying hens，laboratory diagnosis were carried out，such as pathological anatomy，histopathology，PCR and virus isolation. Clinical autopsy sick layers are visible that light yellow clear liquid in pericardium，liver swelling，fatty degeneration and discoloration， renal swelling，uric acid salt precipitation， histopathology observed basophilic intranuclear inclusions in liver nuclei，tissue samples and chicken embryos inoculated allantoic fluid，the PCR amplification product sequencing showed sequence homology with fowl adenovirus-I hexon gene （99%）， so it can define that the isolated virus is fowl adenovirus-I.

Key words： Hubei province； layer； fowl adenovirus-I； infection； diagnostic

2015年10月，湖北省某规模化鸡场不同日龄的产蛋鸡群相继出现死亡情况，患病蛋冠苍白，精神沉郁，食欲不振，排黄绿色粪便。一旦出现临床症状，大部分在3～5 d内死亡，有些无任何特征性症状突然死亡，日死亡率达2%，药物治疗效果不佳，造成的经济损失巨大。该鸡场将患病鸡送检华中农业大学动物医学院实验室，临床剖检可见心包中有淡黄色清亮液体；肝脏肿大，呈土黄色，表面有不同程度的点状或条索状出血，边缘钝厚，质地脆弱易破裂；脾脏肿大，见有灰白色斑点；肾脏肿大、苍白，表面有出血点。

根据该产蛋鸡群的发病情况、临床症状和病理解剖变化及鸡I群禽腺病毒感染症状的报道[1-3]，初步诊断疑似为I群禽腺病毒感染引起的鸡包涵体肝炎。为了进一步确诊，对临床患病蛋鸡开展了组织病理学观察、PCR检测和病毒分离等实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来源于湖北省某鸡场的患病鸡，剖检采集肝脏、脾脏等组织，加入适量的无菌PBS溶液，研磨，-20 ℃保存；另一部分组织样品在100 mL/L的中尔马林溶液中固定。

蛋白酶K购自生工生物工程（上海）股份有限公司、Taq SuperMix购自南京金斯瑞生物科技有限公司；DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自全式金生物技术（北京）有限公司。

PCR仪（BioRad，美国）；电泳仪（北京市六一仪器厂，中国）；凝胶成像仪（BioRad，美国）；小型高速离心机（Eppendorf，德国）。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 ⒉×显冉，反复冻融2～3次后离心取上清，加入双抗，4 ℃下感作过夜。经卵黄囊接种6～8日龄鸡胚，每胚接种0.2 mL。将24～96 h死亡及存活的鸡胚置于4 ℃过夜，次日无菌收获尿囊液，盲传3代。

1.2.2 组织病理 切片取在100 mL/L福尔马林溶液中固定好的患病蛋鸡的肝脏、肾脏、肠道等组织，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，观察组织病变。

1.2.3 DNA的提取 取400 μL病料匀浆样品或收获的尿囊液1.5 mL于灭菌离心管中，加入300 μL消化液（100 mmol/L NaCl、25 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、0.5% SDS、100 μg/mL蛋白酶K），37 ℃消化过夜。在上述消化混合物中加入等体积的苯酚，充分混匀，12 000 r/min离心10 min。取上清，加入等体积的苯酚∶氯仿（1∶1），混匀，12 000 r/min离心10 min；再取上清，用等量的氯仿抽提，12 000 r/min离心10 min。最后取上清加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃放置30 min，12 000 r/min离心10 min沉淀DNA。沉淀用70%的乙醇洗涤1次，空气中自然干燥后悬浮于15 μL灭菌超纯水中，-20 ℃保存备用。

1.2.4 PCR反应 参照I群禽腺病毒hexon基因序列设计PCR引物，扩增片段为470 bp，上游引物：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；下游引物：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用50 μL的PCR体系：DNA 4 μL，上、下游引物各1 μL，Taq SuperMix 25 μL，灭菌超纯水19 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR扩增产物的检测与分析 PCR产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察，拍照记录下结果。切下目的片段，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 临床解剖

患病蛋鸡心包中有淡黄色清亮液体（图1），肝脏肿大，表面有不同程度的点状或条索状出血（图2），呈土黄色，边缘钝厚，质地脆弱易破裂（图3），有的表面可见到大小不等的坏死灶，坏死灶和出血交相混合，使其表面凹凸不平。脾脏肿大，见有灰白色斑点（图4）；肾脏肿大，表面有不同程度的出血点（图5），腺胃出血（图6）。

2.2 组织病理学观察

肝脏的病变普遍且较严重，肝细胞索紊乱，肝索间可见出血、淤血现象；肝组织明显的脂肪变性，肿大，胞浆气泡呈气球样（图7）；细胞间有炎性细胞浸润，同时可见少量的嗜碱性核内包涵体（图8）。

2.3 PCR扩增与测序

PCR电泳检测结果显示，阴性对照孔未扩增出任何片段，病料样品孔与鸡胚尿囊液扩增产物大小与预期片段一致。将分离株的基因测序结果与GenBank中的序列比对，通过DNAStar软件分析，结果显示，分离株与I群禽腺病毒序列同源性为99%，表明被检病料样品和鸡胚尿囊液中含有I群禽腺病毒。

3 讨论

I群禽腺病毒感染主要引起鸡包涵体肝炎和心包积水综合征。心包积水综合征病理变化为心包积液较严重，液体清亮或呈胶冻样，肝脏肿大，呈土黄色甚至褐色，质地脆弱。病理组织切片可见肝细胞脂肪变性、坏死，肝细胞核中可见嗜碱性核内包涵体。针对病料及病料鸡胚传代尿囊液的I群禽腺病毒hexon基因PCR测序结果表明被检病料和鸡胚尿囊液中含有I群禽腺病毒。因此，根据病理解剖、组织病理学观察、PCR检测和病毒分离等实验室检测，该产蛋鸡群确诊为I群禽腺病毒感染引起的鸡心包积水综合征。

I群禽腺病毒广泛存在于鸡、鸭、鹅等的呼吸道和消化道，能使鸡群呈隐性感染，作为继发病原共同作用家禽，并能垂直传播，污染鸡胚。已有研究表明，某些免疫抑制病如传染性法氏囊和传染性贫血与Ⅰ群禽腺病毒有关[1，4，5]。当免疫力低下时，Ⅰ群禽腺病毒较易侵入鸡群，引起导致产蛋下降、再生障碍性贫血和轻度呼吸道疾病。1986年就有报道，之后在少数省份散发[6，7]；2010年至今，该病在山东、江苏、河南、河北、辽宁、山西、内蒙古等省流行[8-10]。

目前，作为原发病原的作用尚不清楚，所以与其致病性有关的因素也不能确定。在本病例中，该规模化鸡场产蛋鸡群因I群禽腺病毒感染导致的死亡率约30%，日死亡率可达2%，造成了严重的经济损失。因此，有必要对该病原是否是原发性病原及其致病性进行深入研究。鸡群感染I群禽腺病毒后能够引起免疫抑制，造成机体对疫苗的免疫应答失败，给养殖业造成了严重的危害。所以，对于该病还是要做到防重于治，家禽养殖场应加强鸡场生物安全措施，减少家禽养殖的损失。

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