电针对局灶性脑缺血模型大鼠皮层BDNF、TrkB的影响

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摘要：目的：观察电针对不同时间点局灶性脑缺血模型大鼠缺血区皮层bdnf、trkb的影响。方法：采用线栓改良法复制大脑中动脉缺血模型（MCAO），采用免疫组化SABC法观察缺血皮层BDNF、TrkB表达情况。结果：BDNF、TrkB阳性神经元主要分布在梗死灶周围皮质区。假手术组大鼠相应区域可见少量阳性神经元表达，且强度较弱；模型组各时间点梗死周围皮质BDNF、TrkB阳性神经元比假手术组明显增多，差异有统计学意义（P

关键词：脑缺血；电针；风府穴；脑源性神经营养因子（BDNF）；酪氨酸激酶B（TrkB）

中图分类号：R285.5；R245.97文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0469-03

Influence of Electroacupuncture on the Expressions of BDNF and

TrkB in Ischemic Cortex of Rats With Local Cerebral Ischemia

WANG Yanchun1,LIANG Shaorong1，MA Jun1,GNA Shuiyong1,WANG Shuju1,

JIANG Chengkun1,LEI jun1,WANG Peijun1,XU Yonghai1,CHEN Jianming2

(1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China;

2.Beijing University of TCM,Beijing 100029,China)

Abstract:Objective:To observe the influence of electroacupuncture（EA）on the expressions of BDNF and its receptor TrkB in ischemic cortex of rats with local cerebral ischemia. Methods:The model of focal cerebral ischemia was set up by blocking up the middle cerebral artery(MCA) with filament in rats．The expressions of BDNF and TrkB positive neurons in ischemic cortex was observed with the method of immunocytochemistry SABC. Results:BDNF and TrkB positive neurons were mainly distributed in cortex around the ischemic focus. In pseudo-operation groups ,BDNF and TrkB positive neurons were few and low-expression in identical area.The expressions of BDNF and TrkB around ischemic cortex of model groups were significantly higher than that of pseudo-operation group(P

Key words:cerebral ischemia;electroacupuncture;fengfu point;BDNF;TrkB

收稿日期：2011-11-27

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30300461,30973787,30973809)；湖北省教育厅科学技术研究资助项目(2002B00004，D200726001，Z20091601)；湖北省科技厅科学技术资助项目（2009CDA068，2010CDA101）；武汉市科学技术局科学技术研究资助项目（201060623269）

作者简介：王彦春（1971-），男，天津人，教授，医学博士，研究方向：中医药防治神经系统变性疾病。

通讯作者：马骏（1964-），女，湖北武汉人，教授，医学博士，研究方向：中医药防治脑病。电针治疗缺血性脑血管病的临床疗效已得到国际公认，其作用是多环节、多通道、多靶点的。已有研究证明脑源性神经营养因子 (BDNF)对缺血性脑损伤具有保护作用[1],其生物学效应主要由高亲和力受体酪氨酸激酶B((TrkB)介导[2]。大量实验也证实[3-6]，电针能上调脑内BDNF的表达水平。本研究选择不同时间点动态观察电针对MCAO模型大鼠缺血区BDNF、TrkB的表达水平，以期从脑源性神经营养因子的环节探讨电针风府穴治疗缺血性脑血管病的可能作用机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组选用清洁级雄性SD大鼠45只（购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。许可证号：SCXK(鄂)2004-0007），体重220~250g，随机分假手术组、模型组和电针组各15只，每组按缺血3、7、14天3个时间点分亚组，每时间点均5只。

1.1.2主要试剂麻醉剂水合氯醛为国产分析纯；BDNF鼠单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；TrkB羊抗鼠抗体，SABC试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.1.3实验仪器设备SD-78双极电凝器；直径026mm黑色尼龙鱼线；G6805-1A型电针仪（上海华谊医用仪器厂）；环球牌30号0.5寸针灸针（苏州针灸用品厂）

1.2实验方法

1.2.1缺血模型制备参照 Longa等[7]介绍的方法并加以改进，制备大鼠右侧大脑中动脉缺血模型（MCAO）。主要步骤：10％水合氯醛（0.4mL／100g）腹腔注射麻醉大鼠，颈正中线右旁开约0.5cm处切口，依次暴露右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉 (ECA)和颈内动脉(ICA)，电凝器凝断ECA和ICA之间交通支，用2个动脉夹分别夹闭CCA近心端和ICA远心端，在ECA远端打两个结后中间剪断，在ECA残端剪一小口，将栓线经缺口插入，用眼科镊轻推栓线进入大脑，当感觉推进有阻力时，说明已阻断大脑中动脉（MCA）的入口，即可造成MCA的栓塞，将ECA上活结扎紧，取下ICA和CCA上的动脉夹，缝合皮肤，肌肉注射青霉素8万U以防感染。假手术组动物除了不予线栓栓塞外，其余步骤均同模型组。

1.2.2行为学检测造模后的动物在自然苏醒后，参照Longa等[7]的5级评分标准对其神经障碍进行评分。淘汰神经功能障碍在0级的动物。

1.2.3治疗方法电针组大鼠在行为学检测后立即行电针治疗。取“风府”穴 (参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》[8])，用针灸针进针4mm,接G6805-1A型电针治疗仪,选择连续波,频率为20Hz，强度以肢体抖动，且大鼠能安静耐受为度。电极连接方法：正极接风府，负极接耳朵。在每天相同时间点予以电针治疗，每天1次，每次30min，分别连续治疗3、7、14天。假手术组、模型组大鼠在相应时间点只捆绑，不针刺。

1.2.4标本采集大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4mL/kg）后，快速打开腹腔，暴露心脏，在心尖部剪一小口，将灌胃针插入左心室，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水，待右心耳处流出澄清液体，换用4%多聚甲醛(pH=7.4)10mL/min灌注至大鼠四肢强直，断头取脑。选取大脑前囟前1mm至前囟后2mm区域脑组织，以确保脑梗死部位包含其中[9-10]。固定24h，脱水、透明、石蜡包埋，行连续冠状切片，片厚5μm。将切片置于37℃烤箱烘干20h，备用。

1.2.5HE染色每组取6张切片常规脱蜡水化，苏木精5min,水洗，盐酸酒精分化20s,充分水洗，弱氨水返蓝20s，充分水洗并浸泡10min，1%伊红酒精溶液染色20min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.6SABC法免疫组织化学染色具体步骤：切片常规脱蜡至水；0.3%H2O2室温浸泡10min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次；热抗原修复，PBS（pH7.4）洗涤2次，10min/次；滴加5%BSA封闭液，室温22℃孵育20min。甩去多余液体，不洗；入一抗(BDNF抗体浓度为1∶200,TrkB抗体浓度为1∶100)，室温22℃孵育4h，PBS（pH7.4）洗3次,2min/次；入生物素化二抗，室温22℃孵育1h，PBS(PH7.4）洗3次,2min/次；滴加SABC复合物，室温22℃孵育1h，PBS(pH7.4）洗4次,5min/次；20minDAB显色，蒸馏水洗3次，5min/次；裱片阴干，常规脱水，透明，树胶封片。对照实验：用0.01M PBS代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。

1.2.7细胞计数与统计从每组动物的免疫组化染色切片中，随机抽取8张，每张大鼠脑缺血部位切片随机取6个不同视野，400倍光镜下计算每个视野的阳性细胞数目，应用SPSS 16.0统计软件对相同时间段不同组样本均数之间进行单因素方差分析。P

2结果

2.1HE染色

假手术组在相应区域可见神经元呈层状分布，各层细胞数量较多，形态完整，神经元与周围组织间无空隙存在。模型组和电针组缺血区及缺血周围区神经元排列紊乱，细胞数量减少，缺血灶中心成堆的神经元丢失。

2.2BDNF免疫组化染色结果

光镜下观察到BDNF阳性神经元主要分布在梗死灶周围皮质部位，以神经元的胞浆内分布为多，表现为棕褐色颗粒。假手术组大鼠相应区域可见少量的BDNF表达，且强度较弱；模型组各时间点梗死周边区BDNF阳性神经元比假手术组明显增多，差异有统计学意义（P

表1各组大鼠缺血区皮质BDNF

免疫阳性神经元数量（±s)

组别n3天7天14天假手术组152.44±0.362.48±0.442.44±0.48模型组147.29±1.93##11.17±1.88##15.04±2.47##电针组1411.77±3.15**17.86±4.15**23.51±5.20**F值37.8468.1780.74注：与相应时间段假手术组比较，##P

2.3TrkB免疫组化染色结果

光镜下TrkB的阳性神经元表现为棕褐色颗粒。假手术组大鼠相应区域可见少量的TrkB表达；模型组各时间点梗死周边区TrkB阳性神经元比假手术组明显增多，差异有统计学意义（P

表2各组大鼠缺血区皮质TrkB免疫阳性神经元数量（±s)

组别n3天7天14天假手术组152.75±0.482.65±0.652.80±0.61模型组1410.74±1.21##12.23±2.54##19.38±1.62##电针组1419.40±3.46**22.62±2.89**28.20±4.65**F值121.48157.256162.153注：##与相应时间段假手术组比较P

3讨论

缺血性脑卒中在祖国医学中归属于“中风”范畴。其基本病机为阴阳失调，气血逆乱，上犯于脑，致脑脉闭阻而发病。“病变在脑，首取督脉”是目前治疗脑缺血疾病的主要选穴原则。风府“穴在项上入发际一寸”，是督脉与阳维脉的交会穴，《难经・二十八难》记载：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑。”可见风府穴与脑关系非常密切，能“治脑中百病”。因此针刺风府穴可沟通阴阳，调和气血，疏通脑络，是治疗中风病行之有效的方法。

BDNF是大脑中含量最多的神经营养因子，对多种神经元的存活和生长、分化及功能的表达起着重要作用。众多的研究表明[11-13]，BDNF能保护神经元抵抗损伤，促进受损神经元的修复与再生。主要通过稳定细胞内Ca2+浓度，减少钙超载引起的损失[14]，保护受损神经元对抗NO介导的细胞毒作用，调节自由基的生成[15]，增强蛋白激酶（PKC）活性实现对脑缺血的神经保护[16]。可见，BDNF的增加可以作为一种内源性的神经保护剂来抵抗脑缺血的损伤，尤其对缺血半暗带区神经细胞的转归产生影响[17]。因此，脑缺血后，增加脑内BDNF的含量是适应机体神经元保护机制。

本实验观察到，BDNF、TrkB阳性细胞在梗死灶中心区表达极少,有的消失，在梗死周边区表达较多，说明梗死中心区神经元已变性死亡，而在梗死周边区的神经元正在修复，抵抗缺血损伤。模型组阳性细胞数量随缺血时间的延长有增加趋势，提示急性脑缺血后，机体在没有外来因素干预的情况下，可以通过自身的代偿来调节内源性的BDNF，促进受损神经元的修复与再生。电针风府穴后，缺血区阳性细胞的含量增多，表达增强，提示电针促进了脑内细胞大量分泌BDNF，从而抵御缺血损伤，修复受损神经元，并能促进梗死灶周围正常神经元轴突出芽、再生，形成新的突触，减少神经元凋亡[18]。很多研究结果表明[3,19]，电针治疗局灶性脑缺血模型大鼠可以增加脑内BDNF的表达，与此实验结果一致。其作用机理包括许多方面，例如，增加缺血区的血液循环，加速自由基清除，提高机体抗氧化能力；改善脑部能量代谢，使脑细胞的形态和功能损害减轻[20]。增强缺血区BDNF表达可能只是其作用机制之一。

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