电针对力竭游泳大鼠肾脏线粒体自由基代谢和线粒体功能的影响

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(1.河南省体工大队医务所,郑州450003;2.河南中医学院针推系)[摘　要]　目的:进一步研究电针的抗过氧化、抗衰老作用,探讨肾俞平衡阴阳、益精补肾机理。方法:选择7组大鼠做力竭游泳实验,观察力竭前后不同时间及有无电针刺激条件下大鼠肾脏线粒体自由基代谢情况和线粒体功能的变化。结果:发现力竭游泳后即刻和4小时末MDA,GSH,NADH,游离Ca2+,THG,GSHPx均有不同特点、程度的变化;电针组大鼠游泳耐力时间明显长于未电针组(P

[主题词]　电针;线粒体/针灸效应;自由基/代谢;游泳

Effect of Electroacupuncture on Metabolism of Mitochondrial Free Radicals and Mitochondrial Function in Kidney in Rats of Full Swimming

Luo Lei1,Xu Xiaojin2(1.Infirmary of Henan Provinces Physical Training Team,Zhengzhou 450003;2.Department of Acupuncture and Massage,Henan College of TCM)

[Abstract]　Purpose　To study further antihyperoxidation and antiageing action of electroacupuncture and preliminarily approach to the machanism of Shenshu(BL 23) in balancing Yin and Yang,supplementing vital essence and tonifying kiidney. Methods　Changes of metabolism of mitochondrial free radicals and mitochondial function in kidney were investigated at different times after full swimming and electroacupuncture.Results　MDA,GSH,NADH,free Ca2+,THG,GSHPx at 0 and 4 hours after swimmimg had changes in varying degrees;the swimming time in the electroacupuncture group was significantly longer than that in the nonelectroacupuncture group.Conclusion　Full swimming can induce a series of hyperoxidation,and production,accumalation and abnormal metabolism of a great number of free radicals in rats;Electroacupuncture at Shenshu can obviously increase the ability of antihyperoxidation,effectively clearing free radicals and increasing motor ability,which reveal preliminarily the mechanism of Shenshu in balancing Yin and Yang,supplementing vital essence and tonifying kidney.

[Keywords]Electroacupuncture;Mitochondria/acup eff;Free Radicals/metab;Swimming

越来越多的研究证实,化学性质极为活泼的自由基可引发机体过氧化反应,导致生物膜损伤、生物分子交联等一系列生理、生化紊乱[1]。人体运动实验显示,长时间有氧运动至力竭可使机体自由基增加,消除能力下降,以致自由基积累,产生疲劳[2]。关于自由基的危害,有研究表明,大鼠长时间大强度运动训练后线粒体膜流动性下降,刚性增加,这是自由基对膜脂质双分子层结构攻击所致[3]。有报道称针刺对中风、脑瘫等患者体内脂质过氧化水平具有一定的良性影响[4]。传统中医认为刺激肾俞可平衡阴阳,益精补肾,这种作用是否有助于肾脏中运动性内源自由基的清除,以及是否有利于肾脏线粒体功能的稳定,从而防治疲劳,提高机体活力,此作用机制的探讨正是本实验目的所在。

1　材料与方法

1.1　材料与分组

(1)选用SD雄性大鼠60只,体重230～280 g,购入后按体重大小随机分为7组,即:安静对照组(A)、力竭游泳结束后即刻组(B)、电针力竭游泳后即刻组(BA)、力竭游泳结束后4 h末组(C)、电针力竭游泳后4 h末组(CA)和耐力测试组(D) ,电针耐力测试组(DA)。除D、DA中每组5只大鼠外,其他各组中大鼠数量均为10只。

(2)每5只大鼠饲养于同一笼中,给以国家标准啮类动物饲料自由饮食,光照时间8:00～19:00,环境温度约12～16 ℃,相对湿度45%～60%。实验前常规饲养22天,以便适应和电针处理。

1.2　实验方法

(1)BA、CA、DA各组大鼠在力竭游泳实验前每日电针双侧“肾俞”穴1次,每次20 min,10次为一疗程,休息2天后再行下一疗程,电针治疗共2疗程。电针采用疏密波(4～20 Hz),刺激强度3 mA。A、B、C、D四组大鼠常规饲养,不施以电针等刺激。

(2)第23天,除A组外的大鼠依次在长120 cm、宽60 cm、高50 cm的玻璃水槽中游泳,水深约40 cm,水温约30 ℃左右。力竭标准定为:连续无负重游泳140 min,若中途力竭,沉入水下达6 s者,捞出水面休息1～2 min,继续游泳至140 min。耐力测试的时间一般长于150 min,连续2次力竭下沉。

(3)分别于力竭游泳后即刻和4 h后经乙醚麻醉处死大鼠(B、BA、C、CA组)。迅速打开腹腔,取出肾脏并置于生理盐水中洗净血液,再用滤纸吸干、称重。以磷酸盐缓冲液(pH 7.2)低温匀浆,用差速离心法离心,制得肾脏线粒体悬浮液。操作面温度0～4℃。

1.3　检测项目与方法

(1)肾脏线粒体丙二醛(MDA)的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法,TBA为上海试剂二厂产品,TEP为Sigma产品。

(2)线粒体还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定用OPT作荧光指示剂,荧光法检测[5]。OPT由中科院有机所提供。谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性测定采用DTB直接法[6]。

(3)巯基(THG)含量测定采用Ellman的DTNB反应法[7]。

(4)还原型辅酶Ⅰ(NADH)荧光值测定采用直接荧光法,与Rodamine B荧光值之比计量。

(5)线粒体内游离Ca2+测定用Fura2AM作荧光探针,根据Mccormark等的方法[8],用日本岛津荧光光度计进行检测,340 nm、380 nm双波激发,505 nm发射。

线粒体蛋白定量用考马氏亮蓝法,为简便起见,以下各指标单位均为蛋白定量后的每mg蛋白含量。各指标数据均用平均值±标准差(±s)表示,两两均数比较采用t检验。

2　实验结果

各项实验指标测定结果如表1和表2

由表1可知,力竭游泳140 min后,B组、BA组、C组MDA含量较运动前(A组)显著升高(P分别

GSH含量,B、C组持续下降(P

力竭游泳后,线粒体内巯基含量下降特点同MDA巯基对于维护线粒体膜的完整性有重要意义。

线粒体内NADH荧光值运动后即刻下降显著(P

线粒体内游离Ca2+浓度运动后即刻下降极显著(P

3　讨论

脂质过氧化物丙二醛(MDA),可作为评价自由基生成及对膜脂质双分子层破坏的指标。本实验结果表明,大鼠力竭游泳后肾脏线粒体MDA含量显著增加,说明力竭时自由基大量积累。另外对抗自由基生成的GSH含量也持续显著下降。GSH的抗过氧化作用与GSHPx活性密切相关。GSHPx是一种含硒的过氧化物酶,它可催化H2O2与GSH反应,生成氧化型谷胱甘肽,从而分解H2O2,防止产生毒性很强的羟自由基。其活性相对于自由基的生成有一定的滞后性,故力竭运动后GSHPx呈现先下降后缓慢回升,数小时后反馈激增的趋势。GSH一直处于被消耗状态,其含量持续下降。中医传统观点认为,肾俞可平衡阴阳,益精补肾。实验发现电针刺激“肾俞”后机体抗过氧化系统能力得以加强,自由基生成减缓,故自由基的积累及其危害减弱。提示电针有利于机体自由基生成与消除之间尽快达到平衡,避免较大生理危害的发生,这是电针肾俞平衡阴阳的可能机制之一。益精补肾作用的机制可能是促使机体在应激状态下迅速有效地产生GSHPx等抗自由基物质,保护肾脏线粒体功能,阻断一系列机体过氧化反应所致的紊乱。

衡量线粒体膜完整性的直接指标常为其表面的巯基含量。当巯基被自由基氧化。含量下降时可导致膜的完整性破坏,Ca2+外流,以致实验所测线粒体内游离Ca2+浓度急速下降。电针组(BA、CA组)Ca2+浓度因电针刺激加强了机体抗过氧化能力,减少了自由基的生成积累,使线粒体膜得到了一定的保护,Ca2+外流被抑制而显著高于未电针组(B、C组)。实验还发现,电针可减缓力竭运动对NADH的消耗。NADH是线粒体内最直接的质子供体,巯基要保持其还原状态,必须有充分的质子供应。这是电针作用保护线粒体膜完整性的又一可能机制。

线粒体内Ca2+浓度下降,可使线粒体内NADH含量下降,还原当量水平降低。这是因为线粒体内NADH主要来源于底物的氧化脱氢反应,比如谷氨酸、异柠檬酸、丙酮酸、α酮戊二酸等在脱氢酸作用下,脱下的氢为NAD+所接受,生成NADH。有3种重要的脱氢酶:丙酮酸脱氢酶(PDH)、NAD+异柠檬酸脱氢酶(NAD+ICDH)和α酮戊二酸脱氢酶(OGDH)可被Ca2+激活。此3种酶统称为Ca2+敏感脱氢酶。Ca2+浓度下降,Ca2+敏感脱氢酶含量也下降,必然导致NADH的减少。所以Ca2+可通过对线粒体内重要脱氢酶的作用来调节线粒体的氧化代谢,而且此调节无需ADP/ATP比值的变化。Korestsky等[10]的实验表明:线粒体内还原当量NAD(P)H是调节线粒体氧化代谢的重要环节。当线粒体外ADP保持恒定,NADH荧光值升高时,耗氧量也明显升高,氧化代谢能力增强,二者呈线型关系。电针可有效抑制Ca2+外流,NADH荧光值下降。线粒体内较高的游离Ca2+通过对敏感脱氢酶的激活,可使NADH含量有效上升,还原当量水平提高,ATP合成率、氧化代谢能力增加。大鼠(电针组)耐力游泳时间亦加长。

4　结论

本实验发现,电针双侧“肾俞”,大鼠肾脏线粒体自由基病理变化减轻,运动能力加强,疲劳延缓。这可能与电针可对自由基的生成、积累产生抑制,加强抗过氧化能力,保护巯基免受自由基攻击,有效抑制线粒体内游离Ca2+外流,提高线粒体氧化代谢能力有关。这也可能是刺激“肾俞”产生平衡阴阳、益精补肾的作用机制之一。

5　参考文献

1　冯伟权,等.运动生化原理.北京:北京体育大学出版社,1995:285

2　陈吉棣,等.一次急性有氧或无氧运动对人体内自由基生成和消除的影响.中国运动医学杂志,1994;10(1):20

3　张宜龙,等.牛磺酸对长期大强度运动训练后大鼠自由基代谢、膜流动性的影响.中国运动医学杂志,1999;18(3):248

4　赖新生,等.三针疗法.广州:广州科学技术出版社,1998:210

5　张哲,等.组织中氧化型和还原型谷胱甘肽荧光测定法.生物化学和生物物理进展,1993;20(2):136

6　Elstner E.F,et al.ThinCheromatography of Lipid.Methods of Enzymology,1991;Vol 14:572

7　Ellman GL,et al.Tissue Sulfhydryl Groups.Archives of Biochom and Biophy,1959;82:70

8　Mccormark J G,et al.Studies on Mitochondrial Ca2+-Transport and Matrix Ca2+ Using Fura-2-Loaded Rat Heart Mitochondria.Biochom Biophys Acta,1989;973:420

9　陈吉棣,等.运动对自由基代谢的影响.体育科学,1991;11(4):57

10　Korestsky,et al.Stimulation by Ca2+ of Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase.Biochem J,1972;128:161

(收稿日期:20000617,齐淑兰发稿)