HPLC法测定人血浆中万古霉素浓度的不确定度评定

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[摘要] 目的 评定液相色谱（hplc）法测定人血浆中万古霉素（VCM）浓度的不确定度。 方法 采用Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为30 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈（91.5∶8.5 pH值3.38），流速1.1 mL/min，检测波长236 nm，柱温35℃。分析并评定HPLC法测定人血浆中VCM浓度过程中的不确定度来源并进行合成。 结果 人血浆中VCM低浓度（2.48 μg/mL）和高浓度（172.2 μg/mL）的扩展不确定度分别为0.168 μg/mL和9.64 μg/ mL（P = 95%，k = 2）。 结论 用HPLC法测定人体血浆中万古霉素浓度的不确定度在高浓度时主要由基质效应、生物样品的配制及重复性引入，在低浓度时主要由回收率、基质效应及生物样品配制引入。

[关键词] 高效液相色谱法；万古霉素；血清；不确定度

[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（a）-0030-05

Uncertainty evaluation on the determination of vancomycinin human plasma by HPLC method

WANG Jiaqing ZHAO Zhigang MEI Shenghui

Department of Pharmacy， Beijing Tiantan Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To evaluate the uncertainty on the determination of vancomycin （VCM） in human plasma by HPLC method. Methods The chromatography was performed on an Aglient ZORBAX SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column with the mobile phase consisting of 30 mmol/L potassiumdihydrogen phosphate-acetonitrile （91.5∶8.5， pH 3.38） at the flow rate of 1.1 mL/min. UV detection was set at 236 nm and the column temperature was set at 35℃. The uncertainty sources in the determinationof VCM were analyzed and the uncertainty was evaluated and combined. Results The expanded uncertainty of VCM at low （2.48 μg/mL） and high （172.2 μg/mL） concentrations were 0.168 μg/mL and 9.64 μg/mL respectively （P = 95%， k = 2）. Conclusion The uncertainty on the determination of VCM in human plasma by HPLC method is mainly caused by recovery， matrix effectand sample preparation for low concentrations， and the matrix effect， sample preparation and repeatability for high concentrations.

[Key words] HPLC method； Vancomycin； Human plasma； Uncertainty

万古霉素（vancomycin，VCM）属于三环糖肽类抗菌药物，临床上主要用于敏感革兰阳性菌，特别是严重耐药的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致的感染，因为此药有耳、肾毒性和血栓性静脉炎等严重的不良反应，故临床应用时常进行血药浓度监测以调整给药方案[1]。万古霉素、去甲万古霉素的浓度测定方法国内外多有报道[2-5]，本实验建立了用HPLC法测定血浆中VCM的浓度。本文采用了测量不确定度来评价分析测试结果的质量。当不确定度值越小时，分析测试结果与真实值越接近，其质量就越高，数据也越可靠[6]。本文根据相关规范和指南评价了HPLC法测定血清中VCM浓度的不确定度，为改进实验方法、提高检测准确度提供参考。

1 仪器与试剂

日本岛津Class-VP高效液相色谱系统；UPW-20n多效蒸馏水器；Mettler AE 163电子天平；ARK PH5-25酸度计；TGL-20M型高速台式冷冻离心机（湘仪器械有限公司）；旋片式真空泵（上海市精工真空设备厂，型号：2XZ-1）。

VCM对照品（SIGMA，批号：BCBD7944V）；去甲万古霉素内标对照品（中国药品生物制品检定所；批号：30339-200303）；乙腈：色谱纯（Fisher公司，批号：67-55-1）；超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以去甲万古霉素作为内标物质，按内标法定量分析。液相色谱柱（Agilent，ZORBAX SB-C18， 184.6 mm×250 mm，5 μm，批号：880975-902），A相流动相为30 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH值3.38），B相流动相为乙腈，流速为1.1 mL/min，柱温35℃，在波长为236 nm处检测，91.5%的A相与8.5%的B相等度洗脱18 min。

则样品制备引入的相对标准测量不确定度为：

2.7.4 萃取过程中引入的测量不确定度（用B类评定程序）

萃取过程（RE）引入的不确定度可由萃取回收率进行评估。评估方法：分别用空白溶剂和血浆配制高、低浓度质控样品，平行测定5次来评估回收率。计算公式：回收率（%）=血浆配制样品萃取后的峰面积/经过前处理的空白基质配制样品的峰面积×100%，内标归一化的回收率（%）=VCM的回收率/IS的回收率×100%。低、高浓度质控样品内标归一化的回收率分别为（98.92±4.35）%和（100.07±4.22）%，则和回收率ur（5）引入的相对标准测量不确定度为：

2.7.5 仪器量化引入的测量不确定度（用B类评定程序）

根据岛津液相仪检定证书，定量测量重复性RSD=2%，按均匀分布原则，k=，则仪器量化引入的相对标准测量不确定度可以表示为：

2.7.6 线性拟合过程中引入的不确定度（用B类评定程序）

标准曲线含有7个浓度，用VCM与IS峰面积的比值对万古霉素浓度进行线性拟合，见表2，用标准曲线反算出的对照品血浆的VCM浓度见表3。

标准曲线包括了7个浓度，n=7，每个对照品浓度测定的次数均为3次，m=3，N为测定标准血浆溶液的总次数，N = m × n = 21；xi为第i个标准血浆溶液的浓度，为7个标准血浆浓度的理论平均值，x=49.5 μg/mL；am为标准曲线的斜率；bm为标准曲线的截距；i为对照溶液的序数（i = 1，2，…，N），j为测定血浆标准溶液的序数（j = 1，2，…，N）。

分别测定低、高浓度质控样品各15次，P = 15，平均浓度xL= 2.48 μg/mL、xH= 172.2 μg/mL，a= 0.0193，则曲线拟合引入的标准测量不确定度为：

则曲线拟合引入的相对标准测量不确定度为：

2.7.7 温度、对照品纯度和样品不均匀性引入的不确定度

实验室温度变化控制在±2°C以内，并且标准曲线和待测样品在同一室温下制备和测定，温度引入的不确定度可以忽略不计。由于对照品纯度测定未提供不确定度，引入的不确定度则不予考虑。本实验中的样品为血浆，使用前经过充分混匀，由样品不均匀性引入的不确定度可以忽略。测量不确定度各分量大小的统计直方图见图2。

2.8 标准测量不确定度的合成及扩展

2.8.1 标准测量不确定度的合成

依据不确定度传播规律对各相对标准测量不确定度进行合成公式为：

。

万古霉素质控样品合成相对标准测量不确定度分别表示为：

0.034， 0.028。

万古霉素质控样品的合成标准测量不确定度分别为：

2.8.2 标准测量不确定度的扩展

用简易评定法，对应的置信概率P = 95% （k = 2），则扩展不确定度分别为：

2.9 测定结果的表示

当置信概率P = 95% （k = 2），血浆中万古霉素低、高浓度质控的测定结果可以分别表示为（2.480±0.168）μg/mL和（172.20± 9.64）μg/mL。

3 讨论

本试验选取天坛医院神经外科开颅术后使用万古霉素的患者。给药方式为VCM 1.0 g静脉内输注1 h，其后以125 mg/h（3 g/d）匀速持续静脉输注72 h。采集静脉血标本，用高效液相色谱法测定VCM浓度，样品的浓度在3.4～103 μg/mL之间。

本文分析了HPLC法测定血浆中VCM浓度的实验步骤和流程确定了不确定度的来源，根据规范、指南[7-9]并参考文献[10-11]，将不确定度各分量进行量化，最后进行合成并扩展。高、低质控浓度回收率引入的不确定度差别很大。表明在进行萃取操作时，为了减小误差，应当制订萃取的标准操作规程并严格执行。生物样品配制引入的不确定度均较大，这与配制样品使用移液器的精密度及使用次数有关。

线性回归对低浓度的影响远大于高浓度，因此线性回归时选择合适的权重以保证低浓度测定的准确性十分必要。由于实验室温度可以控制，而且标准曲线和待测样品需要同时配制，温度变化小，温度引入的不确定度可以忽略不计。样品不均匀性引入的不确定度在固体样品中通常需要评定，而本实验中的样品均为液体，此项可忽略[5-7，9]。

综上所述，用高效液相紫外检测法测定血清中VCM含量的不确定度在高浓度时主要由生物样品配制、回收率和基质效应引入，在低浓度时主要由重复性、生物样品配制、基质效应和回收率引入。

[参考文献]

[1] 黄晓会，刘燕，张健.HPLC法测定人血清中万古霉素及去甲万古霉素浓度及临床应用[J].中国药物应用与监测，2014，11（2）：92-94.

[2] Hu MW，Anne L，Fomi T，et al. Measurement of vancomycin On renally impaired patient samples using a new high・performance liquid chromatographymethod with vitamin B12 internal standard：comparison of high-performance liuid chromatography，emit，and fluorescence polarization immnnoassay methods [J]. Therapeutic Drug Monit，1990，12（6）：562-565.

[3] 丰嘉驹，顾嘉钦.高效液相色谱法测定去甲万古霉素血药浓度[J].中国医院药学杂志，2000，20（8）：458-459.

[4] 涂厉标，王真，李旭梅.高效液相色谱法测定血清去甲万古霉素与万古霉素浓度[J].医药导报，2007，26（5）：485-487.

[5] 戴智勇，李新中，尹桃，等.反高效液相色谱法测定人血浆中万古霉素浓度[J].中国抗生素杂志，2002，27（10）：599-600.

[6] 臧慕文.分析测试不确定度的评定与表示（Ι）[J].分析实验室，2005，24（11）：74-79.

[7] 测量不确定度评定与表示[S].JJF1059.1-2012，2012.

[8] 检测和校准实验室能力认可准则[S].CNAS-CL01，2006.

[9] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL06：2006化学分析中不确定度的评估指南[S].北京：中国计量出版社，2006.

[10] 王猛猛，贺敏，过林，等.LC-MS/MS法测定人血浆中吡啡尼酮的浓度及其方法不确定度评定[J].中国药房，2015， 26（8）：1056-1059.

[11] 过林，裘福荣，王猛猛，等.LC-MS/MS法测定人血浆中双氯芬酸浓度的不确定度评定[J].安徽医药，2015，19（4）：627-631.