中药代谢组学研究中生物样品前处理方法

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作者：邹忠杰，梁生旺，袁经权，龚梦鹃

【摘要】 总结 中药代谢组学研究中生物样品(尿液、血液)的前处理方法，主要包括：尿液中加入缓冲液提供相同的ph值和离子强度，保持代谢物化学位移的恒定。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子物质，增加色谱柱的性能和使用寿命。血液和尿液样品在进行gc?ms分析前要进行衍生化处理。同时，对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结。

【关键词】 中药;代谢组学;样品前处理

abstract: in order to reduce the chemical shift variation,the ph and the consistency of ionic strength were controlled by adding buffer to urine samples. in analysis of blood,efficient removal of macromolecules such as proteins by organic solvent precipitation before injection into an analytical lc column was important in enhancing the performance and extending column lifetime. sample derivatization of blood sample and urine sample before gc?ms analysis was needed. and methods of collection and storage of urine and blood samples were also reviewed.

key words:traditional chinese medicine; metabonomics; pretreatment

代谢组学(metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法，是系统生物学的重要组成部分。中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是 现代 科学 中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。王广基等对代谢组学技术在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分析[1]。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效、作用机制及安全性等研究中的应用[2]。

代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振谱(nmr)、气相色谱?质谱(gc?ms)和液相色谱?质谱(lc?ms)等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术[3]。 nmr由于其具有很高的重现性、一次实验中实现对各种化合物的同时测定、信号强度与其摩尔浓度成正比，可以很容易进行定量分析、借助各种2d?nmr技术可以在对复杂样品不进行进一步分离的前提下实现结构鉴定等诸多优点而被广泛应用[4]。高分辨魔角旋转核磁共振技术(high?resolution magic?angle?spinning nmr spectroscopy)可以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的组织进行测定[5]。lc?ms特别是uplc?q?tof/ms以其灵敏度高、分析速度快、样品无需衍生化等优点，受到众多研究者的关注[6]。gc?ms作为一种经典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛，其最大的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的结构鉴定，而且这也是代谢组学研究中关键的一个环节。气相色谱?飞行时间质谱(gc?tof?ms)由于提供了比四级杆质谱更快的分析速度、更高的分辨率和更准确的分子量应用日益广泛[7]。

可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液、血液、脑脊液、组织和培养液等，最容易获取和应用最广泛的是尿液和血液。人类尿液的ph值一般在5.5～6.5，但在个别情况下可达4.6～8.0。尿液的成分主要是极性低分子量代谢物，其中包括羧酸类如柠檬酸、马尿酸;有机胺类如二甲胺(dma)、三甲胺(tma);氨基酸类如甘氨酸、牛磺酸。nmr测定时，不同ph值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基的解离程度不同，化学位移将发生显著的变化。尿液中还含有一定数量的离子如na+ (90～240 mmol/l)、 k+ (34～68 mmol/l)等，可能产生不同的离子强度和络合作用，同样对代谢物的化学位移产生影响[8]。血液成分比尿液复杂的多，既包括低分子量成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白，lc?ms分析中，蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和使用寿命[9]。因此，十分有必要在分析前利用适当的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响。本文总结了基于nmr、lc?ms和gc?ms技术代谢组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法，希望能为此领域的研究者提供一定的 参考 。

1 尿液和血液的采集与储存

1.1 尿液的采集与储存

一般采集于置于冰上同时加入叠氮化钠(nan3，质量浓度至少为0.05%)作防腐剂的容器中，冷冻储存于-40 ℃的环境中[10]。另有研究报道尿液保存在低于-25℃的环境中，26周之内基本不会发生任何改变，而且不需要加入防腐剂，尽管nan3不会对代谢物产生任何影响。如果要短期(少于1周)储存于4 ℃的环境中，必须加入nan3作防腐剂，理想质量浓度为0.1%(终浓度)[11-12]。

1.2 血液的采集与储存

收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆;收集血液于不含肝素的试管中，冰上凝集来制备血清，离心(1 600 g，15 min，4 ℃)，上清液冷冻储存于-40 ℃的环境中[10]。teahan等报道血浆和血清必须尽快与血细胞分离，距离血液采集时间最好不要超过30 min，以降低血细胞代谢发生的可能性，但是收集血清时凝集时间必须足够长，建议最好不要超过35 min，于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响。血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同[13]。

2 尿液的前处理

2.1 nmr分析中尿液的前处理

如前所述，尿液ph值和离子强度的变化引起化学位移的变化是nmr测定中的首要问题。加入缓冲液一方面提供尽可能相同的ph环境，另一方面减少离子强度不同带来的化学位移的变化， 文献 [10]报道了尿液详细的预处理方法。首先配制ph7.4磷酸缓冲液：称取28.85 g na2hpo4、5.25 g nah2po4、1 mmol/l tsp?d4 和3 mmol/l nan3置于1 l容量瓶中，加入200 ml d2o，然后用水稀释至1 l，强烈震摇使盐全部溶解。400 μl尿液中加入200 μl磷酸缓冲液，离心(12 000 g，5 min，4 ℃)，上清液550 μl转移至5 mm核磁管中。雄黄的安全性评价中采用了类似的方法：400 μl尿液中加入200 μl磷酸缓冲液(0.2 mol/l na2hpo4/0.2 mol/l nah2po4，ph7.4)，静置20 min，离心(3 500 g，5 min，4 ℃)。上清液500 μl加入50 μl tsp?d4/d2o(1 mmol/l终浓度)[14]。lauridsen等[11]报道对于一般的尿液样品缓冲液终浓度要达到0.3 mol/l，对于浓缩的样品要达到1 mol/l，才能较好地保持代谢物化学位移的一致性。上述磷酸缓冲液中，由于na2hpo4·12h2o较低的水溶性(4.2 g/100 g,20 ℃)，因此不可能实现高浓度的缓冲，缓冲液与尿样的比例为1∶2，这必然对样品进行了一定的稀释，从而降低了测定中的信噪比(snr)，而且低温储存时，na2hpo4·12h2o容易析出。xiao等报道了一种改进的缓冲体系：k2hpo4/nah2po4(ph 7.4，1.5 mol/l)，缓冲液与尿样的比例为1∶10，可更好保持化学位移一致性，提高信噪比，减少样品稀释，并且可低温储存[8]。

2.2 lc?ms分析中尿液的前处理

尿液中的成分主要是极性低分子量代谢物，同时含有少量的各种细胞、微量的大分子物质及磷酸盐、硫酸盐等各种盐类物质，这些都有可能对lc?ms分析产生一定的影响。最简单的尿液处理方式是仅用0.22 μm分析滤膜过滤，这可以最大限度保留尿液中的代谢物[15]。为降低尿液基质的干扰，也可以用蒸馏水进行稀释(1∶1～1∶4,体积比)[16-17]，但有可能降低信号强度，部分低含量的代谢物可能检测不到[15]。综合考虑检测到的代谢物的数量、重现性及除去微量蛋白质和各种盐类物质的能力，wong等建议尿液用甲醇(1∶1，体积比)进行稀释[18]。尿液可以先冷冻干燥然后用有机溶剂如甲醇进行提取，这种方法可以获得重现性比较高的结果，而且操作简单[19]。但是这种方法可能会改变尿液的代谢指纹，一方面是由于很难完全溶解冻干产品，另一方面是由于挥发性成分的丢失[11]。

2.3 gc?ms分析中尿液的前处理

尿液中的大部分成分极性比较大而且没有挥发性，因此在进行gc?ms分析前首先要对尿液进行衍生化处理。三甲基硅烷试剂只能用于非水系统，贾伟课题组采用氯甲酸乙酯(ecf))衍生化 gc?ms方法测定大鼠尿液中的内源性代谢物，该方法经多次检验，重复性好、灵敏度高，适用于代谢组学研究的高通量尿液样本检测[20-22]。

3 血液的前处理

3.1 nmr分析中血液的前处理

文献[10,23,24]报道了血液详细的预处理方法。首先配制质量浓度0.9%的生理盐水：称取9 g nacl置于1 l容量瓶中，加入100 ml d2o，然后用水稀释至1 l，强烈振摇使盐全部溶解。200 μl血液中加入400 μl生理盐水， 离心(12 000 g， 5 min， 4 ℃)，上清液550 μl转移至5 mm核磁管中。雄黄的安全性评价中采用了与尿液类似的处理方法：400 μl血液中加入50 μl磷酸缓冲液(0.2 mol/l na2hpo4/0.2 mol/l nah2po4，ph7.4)和50 μl d2o [14]。

3.2 lc?ms分析中血液的前处理

首要的问题是除去血液中的蛋白质等大分子物质，一般常用有机溶剂沉淀法如甲醇或乙腈(3∶1，体积比)，bruce等利用一种全新的两步实验设计法，首先确定了最佳的沉淀剂为甲醇/乙醇(1∶1，体积比)、甲醇/乙腈/丙酮(1∶1∶1，体积比)，与血液样品的体积比为4∶1，然后确定了最佳的旋涡温度和时间分别为4 ℃、15 min[9]。michopoulos等 发展 了一种适合于高通量分析的固相萃取(spe)除蛋白质的方法，在代谢组学研究中其效果优于有机溶剂沉淀法[25]。

3.3 gc?ms分析中血液的前处理

如同尿液一样在进行gc?ms分析前首先要对血液进行衍生化处理。黄欣等采用n?甲基?(三甲基硅烷基)?三氟乙酰胺(mstfa)和三甲基?氯硅烷(tmcs)(100∶1，体积比)作为衍生化试剂[26]。

4 讨论

代谢组学的最终目标是对特定生物样品中所有代谢组分进行定性和定量分析，目前看来还是不可完成的任务。尿液和血液因为其固有的性质，必然会对nmr和lc?ms的分析产生各种不利的影响，因此，在分析前利用适当的方法对样品进行预处理以消除不利因素的影响就显得十分有必要，这也为后续的多变量数据分析、标记物识别和代谢途径分析等奠定了良好的基础。系统生物学尤其是代谢组学的出现，为利用 现代 生物学“语言”阐释传统中医药理论提供了可能，以系统“整体性”观念为出发点，采用近乎无创伤的实验手段和代表整体功能状态的实验对象(采集尿液和血液)，结合现代分析技术和多变量统计分析方法，必将搭建传统中医药和现代医学之间的“桥梁”，推动中药现代化进程，并让国际社会逐渐接受和认同中医药理论体系，最终建立兼容中西医之长的现代生物医学模式。

【 参考 文献 】

[1] 王广基,查伟斌,郝海平,等. 代谢组学技术在中医药关键 科学 问题研究中的应用前景分析[j].