鲤鱼血清白蛋白提取工艺及优化研究

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摘要 以鲤鱼为取血对象，使用等电点沉淀法、盐析法、优化法3种不同工艺提取鱼血清白蛋白，制备好足量血清待用。结果表明：等电点沉淀法所提取的鱼血清白蛋白量最少，其次是盐析法提取鱼血清白蛋白，提取量最多并且纯度最高的是改进的优化法。

关键词 鲤鱼；血清白蛋白；提取工艺；等电点沉淀法 ；盐析法；优化法

中图分类号 TQ464.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）15-0286-01

血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富且极易纯化的蛋白质，是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源性及外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板和抗凝血以及影响动脉血管的渗透性等生理功能。在过去的30年中，它以其特有的地位成为物理学家、化学家和生物学家研究的一种典型的、理想的蛋白质，它也是血浆蛋白中研究的最早和最清楚的组分。人血清白蛋白（human serum album，HSA）及牛血清白蛋白（bovine serum album，BSA）的部分氨基酸序列于1975 年即已得到，1982年得到HSA 的cDNA 全序列。随后，对其他多种动物的血清白蛋白的研究工作也相继展开，如爪蟾血清白蛋白，鲑鱼血清白蛋白等。鱼类是最古老的脊椎动物，相对于大量的牛血清白蛋白、人血清白蛋白研究文献，鱼血清白蛋白的提取工艺文献尚未见报道[1-2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用鱼为鲤鱼，体重1 kg左右，由实验室购买。试验鱼先在室内水族箱暂养3 d，暂养用水为实验室的自来水，期间用气泵进行增氧，暂养期间不喂料。试验容器为方形塑料水箱。试验用水为充分曝气24 d以上的自来水，水温变化范围10～12 ℃，pH值为7.5～8.0，DO值保持在5 mg/L。试验药物使用前，取2个水族箱装满水提前曝气3 d以备试验使用。

1.2 主要试剂与仪器设备

试剂：饱和硫酸铵、1 mol/L盐酸、抗凝剂、奈氏试剂。仪器设备：容量瓶、透析袋、pH计、数显恒温水浴锅、高速冷冻离心机、电炉或加热板、抽滤泵、分析天平等。

1.3 试验方法

1.3.1 血清的制备。鲤鱼的血液从尾静脉中采取，方法是首先用针管吸入少许抗凝剂，然后沿侧线刺入，针头刺到椎骨位置后斜插入椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入部位之前。放入用抗凝剂润洗过的带盖塑料离心管中，加柠檬酸钠抗凝，室温静置3 h，再以3 000 r/min离心15 min，取上清于-20 ℃冰箱冷冻，备用。

1.3.2 等电点沉淀法。将已制备好的冷冻鱼血清解冻，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至2 mL离心管，将血清用1 mol/L盐酸溶液调pH值，当pH计显示到4.6～4.9后，静置2 h后将离心管放入高速冷冻离心机，于4 ℃以3 500 r/min离心15 min，取离心后沉淀溶于1 mL蒸馏水中，将溶液装于透析袋中，放入pH值为7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在。NH4+的检测：取1 mL透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4+存在，需继续透析。

1.3.3 盐析沉淀法。用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管，量筒量取9 mL底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断摇晃或振荡，4 ℃静置2 h后离心，于4 ℃以3 500 r/min离心15 min，收集上清，用1 mol/L盐酸调节pH值至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH=4.5）的体积（0.11×V），逐滴加入饱和硫酸铵（pH=4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h后离心。4 ℃，3 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH=7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解。将剩余的0.4 mL蛋白质溶液加入透析袋中，放入pH=7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在。

1.3.4 优化法。取上清液0.5 mL，向其中加硫酸铵0.5 mL至50%饱和度放置2 h以上，2.4 ℃，3 500 r/min离心15 min后取上清液。上清液用1 mol/L的HCl溶液调pH值至4.0，放置2 h以上，4 ℃，3 500 r/min离心15 min取沉淀。用与库浆等体积的水溶解沉淀，加辛酸钠至浓度为1 mg/L。调pH值至6.4～6.5，70 ℃水浴保温30 min。冷却后加硫酸铵到45%饱和度放置2 h以上，3 500 r/min离心15 min取上清。上清液调pH值到4.0放2 h以上，3 500 r/min离心15 min取沉淀。除盐：将剩余的蛋白质溶液放透析袋中，放入pH值为7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在[3-4]。

2 结果与分析

等电点沉淀法、盐析沉淀法、优化法3种提取工艺1 mL血清提取的白蛋白分别为0.253 8、0.381 5、0.504 8 mg。

蛋白质的溶解度与溶液的pH值有关，通常在溶液的pH值等于某蛋白质的pI值时，该蛋白质的溶解度最小。可是，大幅度改变蛋白质溶液的pH值，极有可能会导致蛋白质变性的危险，于是产生了另一沉淀法，即盐析法。其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，称为蛋白质的盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

试验过程中使用的硫酸铵盐析沉淀法和等电点沉淀法提取工艺产量还不够多，并且产品纯度也不够理想，而且某些步骤尚有改进的必要，血清白蛋白在体内有运载脂肪酸的作用，并且它结合脂肪酸后热变性温度升高，不同的脂肪酸影响程度不同，血清中加入脂肪酸盐进行加热处理可使杂蛋白变性沉淀，因此选用脂肪酸盐为保护剂，结合盐析法和等电点沉淀法的优点，对分离纯化工艺进行了改进，提高了血清白蛋白的质量和纯度[5-6]。

3 结论

通过试验结果得出，等电点沉淀法所提取的鱼血清白蛋白量最少，其次是盐析法提取鱼血清白蛋白，提取量最多并且纯度最高的是通过等电点沉淀法和盐析法改进的优化法。

4 参考文献

[1] 徐云远，葛瑞昌，周桂花.牛血清白蛋白纯化工艺的改进[J].甘肃科学报，1991（1）：51-54.

[2] 林浩然.鱼类生理学[M].广州：广东高等教育出版社，1999：82-83.

[3] 李家增.血液实验学[M].上海：上海科学技术出版社，1997：20-23.

[4] 季钟煜.从极度溶血的牛血中制取牛血清白蛋白[J].生命的化学，1990，10（3）：35-36.

[5] 王世中.用中性盐分离和提纯蛋白质[J].生物化学与生物物理进展，1989（6）：62-63.

[6] 汪学荣，周玲，阚建全.牛血清蛋白的超滤提取工艺研究[J].食品工业科技，2010（4）：230-233.