HPLCMS同时测定益母草制剂中盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的含量
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[摘要]建立益母草制剂中盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的含量测定方法。采用LCMS同时测定盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的含量。使用Waters XBridge Amide 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），以乙腈01%甲酸为流动相，流速10 mL・min-1，分流比为1∶4。质谱条件为ESI离子源，正离子模式，选择性离子扫描（SIM）下对盐酸水苏碱（m/z 1440）和盐酸益母草碱（m/z 3120）进行测定。盐酸水苏碱浓度在0562 8～2814 μg・L-1线性关系良好（r=0999 8）。盐酸益母草碱浓度在0521 2～2606 μg・L-1性关系良好（r=0999 8）。该方法准确、简便、可靠，可作为益母草制剂的含量测定方法。
[关键词]益母草制剂；盐酸水苏碱；盐酸益母草碱；液相色谱质谱联用；含量测定
[Abstract]To establish the quantitative method of stachydrine hydrochloride and leonurine hydrochloride in the preparations of Leonuri Herba The contents of stachydrine hydrochloride and leonurine hydrochloride in the preparations of Leonuri Herba were determined by hplcms The chromatographic column was Waters XBridge Amide（46 mm×250 mm，5 μm） The mobile phase was acetonitrile01% formic acid in gradient mode，at the flow rate of 10 mL・ min-1，with the split ratio of 1∶4 MS conditions for the ESI ion source，positive ion mode，selective ion scan（SIM） of stachydrine hydrochloride（m/z 1440） and leonurine hydrochloride（m/z 3120） was measured The linear ranges of stachydrine hydrochloride was 0562 82814 μg・L-1（r=0999 8） The linear ranges of leonurine hydrochloride was 0521 22606 μg・L-1（r=0999 8） The method is accurate，simple，and reliable，and can be used to determine the contents of stachydrine hydrochloride and leonurine hydrochloride in the preparations of Leonuri Herba
[Key words]preparations of Leonuri Herba； stachydrine hydrochloride； leonurine hydrochloride； HPLCMS； quantitative determination
doi：10.4268/cjcmm20161019
益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt的新鲜或干燥地上部分，收载于《中国药典》2015年版一部[1]，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒的功效。益母草及其制剂广泛应用于妇科多种疾病的治疗，效果良好。盐酸水苏碱、益母草碱已被报道为益母草的有效活性成分[23]。本文采用液相色谱质谱联用在同一色谱条件下同时测定益母草制剂中盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的含量，实现了一测双评的目的，该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好、实用性强，为益母草及其相关制剂的质量标准提高提供参考依据。
1材料
HPLCQDa液相色谱串联质谱联用仪，配备有Alliance e2695高效液相色谱仪和Waters QDa质谱仪 Empower工作站（Waters公司，美国）。AISITE水浴锅。
盐酸水苏碱（批号110712201312，纯度为994%），盐酸益母草碱（批号111823201303，纯度为952%）以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。样品八珍益母丸（北京×××制药厂，批号305342，301367）、抗宫炎片（江西×××药业有限公司，批号20140501，20130627）、八珍益母片（宁夏×××制药有限公司，批号4g01099，4g07022）、八珍益母胶囊（江西×××制药厂，批号130616，140517）、益母草胶囊（沈阳×××制药公司，批号，批号131225，140601）均为市售。水为超纯水。其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
21色谱及质谱条件色谱柱为Waters XBridge Amide 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）01%甲酸水（B） 梯度洗脱0～10 min，80%～65% A；10～12 min，65%～80% A；12～15 min，80% A；流速10 mL・min-1，按照1∶4分流进入质谱仪；柱温35 ℃；进样量10 μL。离子源ESI；离子化模式为正离子模式；选择性离子扫描（SIM）；毛细管电压14 kV；探头温度600 ℃；锥孔电压15 V；以m/z 1440（盐酸水苏碱）和m/z 3120（盐酸益母草碱）为定量离子测定。
22对照品储备液的制备精密称取盐酸水苏碱对照品1407 mg、盐酸益母草碱对照品1303 mg，置25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL至100 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得混合对照品储备溶液。
23供试品溶液的制备取研细的益母草制剂约03 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称重，用70%乙醇补足失重，滤过，精密量取01 mL至100 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
24阴性样品溶液的制备益母草制剂按处方称取缺益母草的其他成分，按制备工艺制成缺益母草的阴性样品，按23项下方法制成缺益母草的阴性样品溶液。
25测定分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入液质联用仪，测定，记录色谱图。样品色谱图中出现与对照品主峰保留时间一致的色谱峰，缺益母草的阴性对照品无干扰，见图1。
26线性关系考察精密量取上述储备液1 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，获得盐酸水苏碱与盐酸益母草碱质量浓度分别为5628，5212 μg・L-1的对照品溶液。再分别精密量取储备液001，05，1，25，5 mL置同一10 mL量瓶中，加70%乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得盐酸水苏碱与盐酸益母草碱质量浓度分别为0562 8，0521 2；2814，2606；5628，5212；1407，1303；2814，2606 μg・L-1的混合对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入液质联用仪，测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品质量浓度X（μg・L-1）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：盐酸水苏碱，Y=1002×105X-6446×103， r=0999 8；盐酸益母草碱，Y=1602×105X-625×104，r=0999 8。结果表明盐酸水苏碱与盐酸益母草碱对照品质量浓度分别在0562 8～2814 μg・L-1与0521 2～2606 μg・L-1线性关系良好。
27仪器检出限在选定的色谱条件下，按信噪比3∶1计算，测得盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的检出限约为005 μg・L-1。
28定量限在选定的色谱条件下，按信噪比10∶1计算，测得盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的定量限约为02 μg・L-1。
29精密度试验精密吸取26项下盐酸水苏碱与盐酸益母草碱质量浓度为2814，2606 μg・L-1的对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得盐酸水苏碱峰面积的RSD为13%，盐酸益母草碱峰面积的RSD为16%，结果表明仪器精密度良好。
210重复性试验分别取同一批号的益母草各制剂样品按23项下方法分别制备6份供试品溶液，依法测定并计算，八珍益母丸、抗宫炎片、八珍益母片、八珍益母胶囊、益母草胶囊的结果平均含量为盐酸水苏碱0685 7，1979，2358，1051，5373 mg・g-1，RSD分别为23%，22%，26%，29%，17%；盐酸益母草碱分别为0941 9，0088 1，0467 0，0886 2，1312 1 mg・g-1，RSD分别为26%，19%，23%，24%，16%，表明重复性良好。
211稳定性试验取同一批号的益母草各制剂样品配制后的供试品溶液，于配制后的0，6，12，24，36，48 h，精密吸取10 μL，注入液相质谱仪，记录峰面积，八珍益母丸、抗宫炎片、八珍益母片、八珍益母胶囊、益母草胶囊的盐酸水苏碱峰面积的RSD分别为13%，16%，21%，27%，25%，盐酸益母草碱峰面积的RSD分别为26%，27%，19%，23%，17%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。
212加样回收率试验分别精密称取6份已知含量的益母草各制剂样品约015 g，置具塞锥形瓶中精密加入盐酸水苏碱与盐酸益母草碱浓度分别为0562 8与0521 2 g・ L-1对照品溶液05 mL，照23项下方法制备供试品溶液。依法测定并计算，结果八珍益母丸、抗宫炎片、八珍益母片、八珍益母胶囊、益母草胶囊的盐酸水苏碱平均回收率分别为9963%，9970%，1015%，9957%，9957%，RSD分别为11%，11%，26%，14%，12%；盐酸益母草碱平均回收率分别为9953%，9946%，1001%，9955%，9935%，RSD分别为16%，13%，13%，14%，12%。表明本方法回收率良好。
213样品含量测定精密称取10个样品各2份，按23项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按21项下的色谱及质谱条件进样测定，以外标法定量计算样品含量，色谱图见图1，2，表1。
3讨论
31测定成分的选择以益母草为君药的中药成方制剂中有显著药理活性的为以盐酸水苏碱与盐酸益母草碱为主的生物碱类，且《中国药典》2010年版一部益母草药材项下也选择这2个成分作为指标成分。其中盐酸水苏碱对心力衰竭症状有明显的临床疗效[45]，并通过抗氧化作用来保护肾脏[6]。盐酸益母草碱能减少子宫出血量、抑制子宫出血[7]，更有报道含有益母草的复方中成药能减少药流后大鼠子宫出血[8]。因此，选择这2个组分同时作为检测指标可以更好地控制成药质量，有一定的实际意义。
32仪器的选择益母草收载于《中国药典》
010年版一部。益母草含量测定项下盐酸水苏碱的测定采用丙基酰胺键合硅胶柱，HPLCELSD；盐酸益母草碱测定采用HPLCUV。在《中国药典》2015年版中，仍然使用上述方法进行测定。中成药八珍益母丸、抗宫炎片、八珍益母胶囊收载于《中国药典》2010年版一部。其中八珍益母丸，君药益母草仅有显微鉴别项，而无含量测定项。抗宫炎片与八珍益母胶囊标准中选择采用薄层色谱方法通过检测盐酸水苏碱对益母草进行质控。益母草胶囊收载于《中国药典》2010年版第二增补本中，标准中采用强离子交换（SCX）色谱柱，HPLCUV测定盐酸水苏碱单一成分。而八珍益母片部分厂家还在沿用卫生部药品标准中药成方制剂第六册的检验标准，该标准中是通过化学显色反应对益母草碱进行质控[9]。
益母草碱这类结构中没有共轭体系存在，在高效液相色谱测定时，需要使用190 nm末端吸收或蒸发光散射检测器进行测定[1011]，对仪器要求较高，重复性难以保证。也有文献使用HPLCMS/MS测定其含量[12]，但HPLCMS/MS仪器价格昂贵，维护保养周期短，操作复杂，难以普及。近年来，质谱仪器不断普及，在中药质量控制的应用也越来越广泛。本文选择QDa这一小型质谱进行试验，主要是考虑到此类质谱具有品牌众多，价格低廉，操作简便，维护保养成本低等优点，从而使质谱进入日常检测成为可能。从实验结果来看，本文所建立的方法与已有的HPLCUV与HPLCELSD等方法相比，具有灵敏度高，重复性好，基线平稳等优点，可满足药品质量控制的需要。
33色谱柱的选择盐酸水苏碱与盐酸益母草碱极性较大，相对于反相色谱柱正相的HILIC柱子对于极性化合物有更好的分离效果。
34质谱条件的选择在选择电离模式时，实验比较了正、负 2种离子模式。实验结果显示，本文测定的生物碱类化合物在正离子模式下较易电离，灵敏度较高，故最终选择正离子模式进行测定。
[参考文献]
[1]中国药典. 一部[S]. 2015：290.
[2]熊莺，杨解人. 益母草碱对大鼠急性心肌缺血损伤血管舒缩功能及抗氧化作用的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2008，14（7）：34.
[3]马玉红，杨解人. 水苏碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2006，12（5）：40.
[4]郭炜，章忱，廖月玲，等. 益母草水苏碱对肥大心肌细胞活性氧信号的影响[J]. 中药材，2012，35（6）：940.
[5]Blaxall B C，Spang R，Rockman H A，et al . Differential myocardial gene expression in the development and rescue of murine heart failure [J]. Physiol Genomics，2003，15（2）：105.
[6]Salom MG，Ceron SN，Rodriguez F，et al. Hemeoxygenase1 induction improves ischemicrenal failure：role of nitricoxide and perox ynitrite [J]. Am J Phsiol Heart Circ Physiol，2007，293（6）：H3542.
[7]李霞，陈飞虎. 益母草碱对药物流产后大鼠子宫的作用研究[J]. 中国临床药理学与治疗学，2009，14（5）：481.
[8]梅劫，吴丽春. 宫血宁胶囊减少药物流产后出血256例临床观察[J]. 中国药业，2007，16（17）：48.
[9]卫生部药品标准中药成方制剂. 第6册[S]. 1992：6.
[10]汪祺，鲁静. 高效液相色谱法测定益母丸中盐酸水苏碱含量[J]. 药物分析杂志，2010，30（4）：710.
[11]陈碧莲，祝明，黄卫国，等. 亲水作用色谱蒸发光散射法测定益母草中盐酸水苏碱的含量[J]. 药物分析杂志，2012，32（3）：502.
[12]赵勇，胡娟妮. 液质联用法测定妇宁丸中盐酸水苏碱的含量[J]. 药物分析杂志，2014，34（2）：345.