辛伐他汀对大鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响

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【关键词】 辛伐他汀；,骨髓基质细胞；,骨质疏松；,成骨细胞；,核心结合因子

Effect of simvastatin on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells in rats

【Abstract】 AIM: To study the effect on osteoblastic differentiation and proliferation of bone marrow stromal cells in vitro by administration of simvastatin in vivo and to elucidate the mechanism of the anabolic osteogenetic effect of simvastatin. METHODS: Thirty 3monthold virgin female SD rats, weighting 250-300 g were randomly divided into 3 groups: Group 1, control, 10 rats; Group 2, given simvastatin 10 mg/(kg・d), 10 rats; Group 3, given simvastatin 20 mg/(kg・d), 10 rats. All of the animals were given the agents through gastric tube for 28 d. At 29th day all the rats were sacrificed. Bone marrow stromal cells in femur and tibia were cultured in vitro. After treated with same condition for 14 d ALP activity of bone marrow stromal cells in supernatant was determined. The mRNA level of cbfa1 was detected by RTPCR, and cbfa1 protein expression was analyzed by Western blot. Cell count kit (CCK8) was used to examine the cell proliferation. RESULTS: After the rats were administrated with differentdose simvastatin in vivo for 28 d, and then the bone marrow stromal cells were cultured for 14 d in vitro, the level of cbfa1 mRNA was increased, and the expression of cbfa1 protein also increased in a dosedependent manner, and supernatant ALP activity increased in a dosedependent manner. Ttest showed that the proliferation of bone marrow stromal cells in Group 2 had significant difference, but no significant difference in Group 3, when compared with control group. CONCLUSION: Simvastatin leads to the high expression of cbfa1 in bone marrow stromal cells and increased ALP activity, which may be parts of the mechanisms underlying the anabolic osteogenetic effect of simvastatin.

【Keywords】 Simvastatin; bone marrow stromal cell; osteoporosis; osteoblast; cbfa1

【摘要】 目的：研究辛伐他汀体内给药后对大鼠骨髓基质细胞在体外培养过程中成骨分化和增殖的影响，探讨其刺激成骨的作用机制. 方法：30只SD雌性大鼠，随机分为3组，每组10只. G1组（C）为对照组；G2组（SIM10）给予辛伐他汀10 mg/(kg・d)；G3组（SIM20）给予辛伐他汀20 mg/(kg・d). 连续给药28 d后，取大鼠的骨髓细胞体外培养，诱导14 d后用RTPCR和Western blot分别检测cbfa1 mRNA和蛋白表达的变化；收集上清液，检测细胞碱性磷酸酶；应用cell counting kit(CCK8) 测定细胞增殖情况. 结果：辛伐他汀体内干扰28 d后，再经过骨髓细胞体外培养诱导14 d后，cbfa1因子的mRNA及蛋白表达水平均增高，呈剂量依赖关系. 上清液碱性磷酸酶表达增高，呈剂量依赖关系. 实验组与对照组比较，G2组（10 mg）组促进细胞增殖，而G3组（20 mg组）未见显著性差异. 结论： 辛伐他汀可促进骨髓基质细胞中cbfa1 mRNA和蛋白的表达，碱性磷酸酶活性增高，辛伐他汀刺激成骨的作用机制可能与此有关.

【关键词】 辛伐他汀； 骨髓基质细胞； 骨质疏松； 成骨细胞； 核心结合因子

0引言

他汀类药物是竞争性3羟基3甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂，能够降低肝内胆固醇的生物合成. 是近20 a来发展起来的一类新型调脂药，目前广泛用于治疗高胆固醇血症. 1999年Mundy等［1］经过动物实验筛选了30 000多种天然或人工化合物后发现，他汀类药物可引起成骨细胞系的骨形成蛋白2（BMP2）的高表达，并能有效地刺激骨形成. 继Mundy之后，同样的发现，通过灌胃法口服给药（辛伐他汀），正常及去势大鼠［2］ 皆可见小梁骨量增加. 并伴随成骨作用有破骨细胞数量的减少. 在临床的回顾性研究中也发现，服用他汀类药物可以增加血清中骨钙素（osteocalcin,OCN）的水平［3］. 并降低股骨颈骨折的发病率［4-5］. 但具体作用机制尚不清楚，辛伐他汀对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的作用如何，目前国内外少见报道. 本研究采用体内给药然后体外对骨髓基质细胞培养诱导的方法，旨在观察辛伐他汀对骨髓基质细胞（BMSc）成骨分化的影响，以探讨其促进骨形成，治疗骨质疏松的机制.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物30只3 mo龄雌性SD大鼠（郑州实验动物养殖中心提供. 动物合格证号为医动字第410117号）平均体质量250~300 g. 所有受试大鼠均置于动物房中饲养1 wk，以适应环境. 然后随机分为3组，每组10只. G1组（C）为对照组, G2组（SIM10）给予辛伐他汀10 mg/(kg・d), G3组（SIM20）给予辛伐他汀20 mg/(kg・d).

1.1.2材料DMEM培养基（Sigma）, β甘油磷酸钠(Sigma)，维生素C(Sigma)，辛伐他汀（商品名：西之达，国药准字H20000007）浙江瑞邦药业有限公司生产，碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物制品有限公司)， CCK8(日本协和化学研究所)，Trizol(Invitrogen), MMLV逆转录试剂盒(BBI公司), Taq DNA聚合酶(BBI公司), 引物由北京华美生物工程公司合成.. 兔抗 cbfa1抗体，辣根酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗，ECL发光试剂盒均购自美国SantaCruze公司.

1.2方法

1.2.1给药方法各亚组动物分笼，标准固体饲料和自由饮水摄食喂养，光照12 h，黑暗12 h，室温为（25±2）℃左右. 各实验组动物于手术后次日通过灌胃给药，对照组给予安慰剂灌胃. 连续灌胃给药28 d后处死所有动物.

1.2.2骨髓基质细胞的体外培养无菌条件下，处死的大鼠即刻取双后肢股骨和胫骨，将其附着肌肉和结缔组织分离干净. 用DMEM培养液（青霉素100 u/mL，链霉素100 μg/mL，100 mL/L胎牛血清，维生素C 50 μg/mL，β甘油磷酸钠10 mmol/L）反复冲洗骨髓腔，收集细胞于离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，细胞重悬后反复吹打成单细胞悬液，细胞计数板计数，接种于培养瓶中，50 mL/L（体积分数）二氧化碳，37℃温箱中培养. 24 h后换液，以后，每2~3 d更换培养液，弃掉未贴壁的悬浮细胞. 至细胞融汇成致密单层后进行传代，细胞计数后接种于培养瓶和培养板中.

1.2.3RTPCR骨髓基质细胞在体外培养诱导14 d后，采用Trizol一步法提取细胞总RNA,RNA定量后反转录合成第一链后进行PCR， PCR反应体系: 总体积25 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL, 25 mmol/L MgCl2 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP 0.5 μL, 引物(25 μmol/L)各1 μL, Taq酶0.25 μL (5 U/μL)，cDNA模板2.5μL. PCR引物的序列: Cbfa1(扩增产物为 240 bp)上游引物： 5′CCCAACTTCCTGTGCTCC3′，下游引物：5′AGTGAAACTCTTGCCTCGTC3′)；GAPDH(扩增产物为288 bp)的上游引物: 5′TGCTGAGTATGTCGTGGAG3′ ,下游引物: 5′GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT3′. PCR反应条件：cbfa1为95℃ 5 min； 94℃ 30 s； 55℃ 45 s； 72℃ 50 s； 35个循环；72℃ 10 min. GAPDH为95℃ 4 min；94℃ 30 s；54℃ 40 s； 72℃ 35 s；30个循环；72℃ 10 min. 循环结束后取扩增产物5 μL于20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳后再经溴化乙碇染色，最后将凝胶置于凝胶成像分析系统中扫描检测各条带的光密度值并求出与内参照物GAPDH的光密度比值.

1.2.4Western blot5 cm×5 cm培养瓶内细胞在经过诱导培养基诱导14 d后，细胞刮刀收集细胞. 细胞浆白抽提缓冲液［5］〔A：10 mmol/l HepesNaoH(pH 7.8), 15 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 1 mmol/L PMSF, 1 μg/mL Leupeptin. B: 20 mmol/L HepesNaoH(pH 7.9), 1.5 mmol/L MgCl2, 0.42 mol/L NaCl, 0.2 mmol/l EDTA, 250 mL/L(体积分数)甘油， 0.5 mmol/L DTT, 0.5 mmol/L PMSF, 1 μg/mL Leupeptin. PMSF使用时临时加入. 〕顺序抽提提取白. 考马斯亮蓝G250蛋白定量，取相同蛋白量的样品，以排除细胞量的差别，SDSPAGE电泳，转膜，封闭液（50 g/L脱脂奶粉TBS+1 mL/L Tween20）封闭过夜，1∶200（体积比）稀释的兔抗Cbfa1多克隆抗体第一次杂交，室温温育2 h后，TBST洗膜3次以上，每次不少于5 min. 然后辣根酶标记的羊抗兔Ⅱ抗第二次杂交，室温温育1.5 h即可，洗膜后ECL发光试剂盒发光，显影，定影. 密度扫描仪定量分析.

1.2.5ALP（碱性磷酸酶） 活性的检测细胞培养14 d后，取培养液上清，ALP检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性，单位为nkat/L.

1.2.6细胞增殖的测定将消化所得细胞以2×104/mL密度接种于96孔培养板，每组50孔，每孔培养基总量为100 μL，次日起每天选择各10孔细胞，连续测5 d，每孔加入CCK8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h停止，在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值（波长450 nm，参比波长655 nm），以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线.

统计学处理： 实验数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件包进行分析. 不同给药剂量的实验组与对照组进行方差分析及Dunnettt检验，P＜0.05，具有统计学意义.

2结果

2.1倒置相差显微镜下细胞形态观测骨髓细胞接种后6~8 h，骨髓基质细胞（BMS）开始贴壁. 随培养时间延长，未贴壁的悬浮细胞死亡或随细胞液丢弃. 培养瓶中只有贴壁的骨髓基质细胞，骨髓基质细胞呈典型梭形或多角形的成纤维细胞. 培养约5~6 d后，细胞融汇至0.8左右.

2.2RTPCR骨髓基质细胞在辛伐他汀给药组中cbfa1的mRNA水平较对照组升高，G3组（20 mg组）水平更高（P<0.01,表1，图1）.表1不同组别cbfa1 mRNA的表达(略)

2.3Western blot结果显示辛伐他汀给药组G2 和G3组较对照组白cbfa1表达增高，而G3组（20 mg组）表达更高(P<0.01,表2，图2).表2不同组别cbfa1蛋白的表达(略)

2.4上清液ALP活性辛伐他汀给药组ALP活性高于对照组. G3组（20 mg组）增加更显著(P<0.01, 图3）.

2.5细胞增殖与对照组比较，辛伐他汀给药组中，G2组（10 mg组）与对照组比较有统计学差异（P<0.01），可促进骨髓细胞增殖，而G3组（20 mg组）未见统计学差异(P>0.05, 图4).

3讨论

通过本实验我们发现辛伐他汀促进大鼠成骨细胞相关因子ALP及cbfa1基因的表达，从而促进骨髓基质细胞的成骨分化，10 mg组有促进成骨细胞增殖的作用.

骨髓基质细胞作为一种多能干细胞，在特定条件下不仅可分化为成骨细胞，还可分化为脂肪细胞，成软骨细胞，甚至神经细胞等［7］. 而在骨组织工程学和骨质疏松治疗学方面，如何能有效的刺激BMSc定向诱导分化为成骨细胞，具有重要的理论和应用价值. ALP是成骨细胞的特异表型，ALP的活性在一定程度上反映成骨细胞分化程度和功能状态. 其活性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显. 宋纯理等［8-9］发现在辛伐他汀对骨髓基质细胞体外培养干扰过程中，ALP活性明显增高，BMP2高表达并呈现剂量依赖关系OCN，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达水平增高，呈现剂量依赖关系. 本研究结果与其一致，提示辛伐他汀有促进骨髓基质细胞向更多成骨细胞分化的潜质，并且可能具有刺激分化成熟的成骨细胞的成骨功能.

新近研究表明，核结合因子a1 即cbfa1转录因子是调节成骨细胞生成的关键因子，属于Runt结构域家族，因此又称Runx2（Runt related gene 2）. Cbfa1是成骨细胞分化早期的标志物，它可调节OCN基因表达. Ducy等［10］在小鼠和大鼠骨钙素基因启动子区发现了与cbfa1的Runt结构域特异性结合的连接基序，即成骨细胞特异性作用元件2（OSE2）. 随后又发现在Ⅰ型胶原（COI1）， OPN,骨结蛋白（ON）等成骨细胞标志基因中也存在这种启动子元件，cbfa1通过调节这些基因在成骨细胞的表达，来促进成骨细胞的分化和成熟. 当非成骨细胞异位表达cbfa1时，可使这些细胞表达骨钙素，而缺乏cbfa1基因的小鼠骨组织仅有软骨细胞和软骨，而无骨形成［11］. 人类常染色体显性遗传病锁骨颅骨发育不良综合症就是由cbfa1一个等位基因突变引起［12］. OPG（osteoprotegerin）是由成骨细胞分泌的破骨细胞分化和功能的抑制因子，其在体外培养细胞中的表达也同cbfa1密切相关［13］. 本实验中可见到辛伐他汀促进了cbfa1因子mRNA和蛋白的表达，说明辛伐他汀可通过提高cbfa1因子的表达来促进BMS分化为成骨细胞，从而使成骨细胞表达增强.

Cbfa1表达也受许多生长因子，激素以及转录因子的影响，Viereck等［14］报道cbfa1为成骨细胞分化成熟过程中BMP2, TGFβ和地塞米松的靶基因. 其中BMP是促进成骨细胞分化有效的细胞外因子，这类因子可通过Smads信号途径诱导cbfa1表达，并可能通过调节cbfa1Osx和其他转录因子来影响成骨细胞分化［15］. 他汀类药物进入体内后以前体药物的形式对蛋白酶体有抑制作用，进而抑制了BMP的下游信号调节蛋白Smad的降解，使BMP的含量增加. 但其明确，具体的作用靶点和途径机制有待进一步研究和证实.

目前已知与增殖激活有关的基因有cmyc, cfos, cjun, 与细胞周期有关的基因有组蛋白，细胞周期素基因. H4组蛋白的基因表达伴随细胞内DNA的合成，与增殖密切相关. 本实验中10 mg组促进细胞增殖，而20 mg组与对照组比较未见显著性差异. 辛伐他汀对增殖作用的机制是与激活相关基因有关还是与细胞周期基因有关，是否存在双向作用机制，即在较低剂量时促进成骨细胞增殖，而在较高剂量时抑制成骨细胞增殖尚待进一步研究证实.

目前，辛伐他汀已成为治疗骨质疏松的新型药物，对其成骨作用做了大量研究，但其临床应用尚待进一步证实，同样也有报道［16］，辛伐他汀可促进小鼠骨折愈合. 对骨折愈合的相关因子表达和具体作用机制未见其他报道. 因此，通过体内外实验探讨辛伐他汀对成骨作用的机制，为他汀类药物用于临床骨质疏松和骨折愈合治疗提供依据，将更有意义.

【参考文献】

［1］Mundy G, Garret R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins ［J］. Science, 1999,286:1946-1949.

［2］Maria P, Waldemar J, Malgorzata MM, et al. Effects of simvastatin on the development of osteopenia caused by ovariectomy in rats［J］. Pol J Pharmacol, 2003,55:63-71.

［3］Chan MH, Mak TW, Chiu RW, et al. Simvastatin increases serum osteocalcin concentration in patients treated for hypercholesterolaemia［J］. Clin Endocrinol Metab, 2001, 86:4556-4559.

［4］Meier CR, Schlienger RG, Kraenzlin ME, et al. HMGCoA reductase inhibitors and risk of fracture［J］. JAMA, 2000, 283: 3205-3210.

［5］Chan KA, Andrate SE, Boles M, et al. Inhibitors of hydroxymethylglutarylcoenzyme A reductase and risk of fracture among older women ［J］. Lancet, 2000, 355: 2185-2188.

［6］王勇，黄文华. 一种改进的核转录因子的电泳迁移率改变分析法［J］. 第三军医大学学报, 2001，23：119-120.

［7］Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potennial ofhuman mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999, 284:143-147.

［8］宋纯理,党耕町,郭昭庆,等. 辛伐他汀对骨髓基质细胞骨形成蛋白2表达及对碱性磷酸酶的活性的影响［J］.中国修复重建外科, 2002, 16（6）：384-387.

［9］宋纯理, 党耕町, 等. 辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化 ［J］. 北京大学学报（医学版），2003, 35: 533-536.

［10］Ducy P, Zhang R, Geoffroy A, et al. Osf2/Cbfa1:A transcriptional activator of osteoblast differentiation［J］. Cell, 1997, 89:747-754.

［11］Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts ［J］. Cell, 1997, 89 (5):755-764.

［12］Mundlos S, Otto F, Mundlos C, et al. Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dysplasia ［J］. Cell, 1997, 89(5):773-779.

［13］Thirunavukkarasu K, Halladay D L, Miles R R, et al. The osteoblastspecific transcription factor cbfa1 contributes to the expression of osteoprotegerin, a potent inhibitor of osteoclast differentiation and function［J］. J Biol Chem, 2000,275(33):25163-25172.

［10］Viereck V, Siggelkow H, Tauber S, et al. Differential regulation of cbfa1/Runx2 and osteocalcin gene expression by vitaminD3, dexamethasone, and local growth factors in primary human osteoblasts［J］. Cell Biochem, 2002,86(2):348-356.

［15］Yamaguchi A, Komori T, Suta T. Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and cbfa1 ［J］. Endocr Rev, 2000, 21 (4):393-411.

［16］Skogund B, Forslund C, Aspenberg P. Simvastatin improves fracture healing in mice ［J］. J Bone Miner Res, 2002, 17:2004-2008.