尼美舒利对人宫颈癌Hela细胞株的抑制作用及其机制研究

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[摘要] 目的 探讨尼美舒利体外抗宫颈癌的活性及相关机制。 方法 采用体外培养的Hela细胞株为研究对象，MTT法检测尼美舒利对Hela细胞的抑制率，倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变，Western blot检测细胞凋亡关键蛋白环氧化酶-2（COX-2）、Caspase-3的表达变化。 结果 尼美舒利可显著抑制Hela细胞增殖，形态学观察发现尼美舒利可诱导肿瘤细胞凋亡；尼美舒利还可抑制Hela肿瘤细胞COX-2表达，引发Caspase-3促凋亡蛋白Caspase-3高表达。 结论 尼美舒利具有明确的抑制宫颈癌细胞的作用，其机制之一可能是通过抑制COX-2引发肿瘤细胞的凋亡。

[关键词] 尼美舒利；宫颈癌；环氧化酶-2；Caspase-3

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（a）-0004-04

近年来研究发现环氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）与人类恶性肿瘤的发生密切相关，COX-2选择性抑制剂尼美舒利可对乳腺癌、胃癌、肝癌等发挥有效的抗肿瘤作用[1-7]。宫颈癌为女性最多发的恶性肿瘤之一，目前各种预防和治疗药物疗效均不理想或毒副作用较大。本研究对尼美舒利的体外抗肿瘤活性进行了研究，并深入探讨了相关机制，为其临床抗肿瘤研究提供实验依据，以期为宫颈癌的防治开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌Hela细胞株（Foucsbio公司）；尼美舒利半乳糖苷（中国药品生物制品检定所）；胎牛血清、DMEM培养基为Invitrogen公司产品；Caspase-3、COX-2和β-actin一抗购自Calcam公司；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG购自Promega公司；Super Signal ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司；蛋白定量试剂盒（Bradford）、β-巯基乙醇、过硫酸氨等均购自上海生工公司。细胞培养皿和96孔培养板（Corning公司）；蛋白电泳及转膜装置（Bio-rad）；分光光度计（Beckman公司）；倒置显微镜（Olymmpus），透射电子显微镜（PM-1200PX型）。

1.2 细胞培养

Hela细胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液，培养在37℃、5%CO2的细胞培养箱中。细胞每隔2 d以1∶3的比例传代1次。

1.3 尼美舒利对Hela细胞增殖抑制率检测

取对数生长期的Hela细胞，以4×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100 μL，每组各设置6个复孔，培养24 h后吸弃原培养液，加入含不同浓度（0、100、200、400、800 μmol/L）尼美舒利200 μL。分别于24、48和72 h，向每孔中加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，小心吸弃全部上清液，然后向每孔中加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡10 min至结晶全部溶解，于酶标仪上490 nm波长处测量吸光度（A）值。实验重复3次，按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=×100%。

1.4 细胞形态学观察

1.4.1 倒置显微镜观察 对数生长期的人宫颈癌Hela细胞经0.1%胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104个/mL，接种于24孔板，每孔1 mL。Hela细胞分为对照组0 μmol/L、200 μmol/L尼美舒利组和400 μmol/L尼美舒利组，按分组药物浓度加入尼美舒利。细胞继续培养48 h后，倒置显微镜观察。

1.4.2 透射电镜超微结构观察 Hela细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，4×104个/孔接种到6孔培养板中，37℃下5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h。待细胞完全贴壁后，吸弃培养液，分别换上含有0、200、400 μmol/L尼美舒利的培养基，培养48 h后，收集约107个细胞，以1 500 r/min离心10 min，形成细胞团。4℃下用2.5%戊二醛固定1 h，再用1%四氧化饿4℃下固定20 min。室温下丙酮脱水，再经浸透、包埋、修块、切片等程序制成50～70 nm超薄切片，铅染液电子染色后，JEM-1200EX型透射电镜下观察细胞超微结构。

1.5 免疫印迹法检测Caspase-3、COX-2蛋白表达

分别用溶剂（空白对照组）和400 μmol/L尼美舒利（尼美舒利组）处理Hela细胞，作用24、48及72 h后，Western blot法检测Caspase-3及COX-2蛋白表达水平，β-actin为内参蛋白，具体步骤如下：收集处理后细胞，预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，加入蛋白匀浆液（50 mmol/L，This-HCl，PH 7.4，1%Triton X-100， 0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA），用4℃超速离心机以12 000 r/min离心10 min，取上清，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，10 μg/well，电泳结束后，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜上，Caspase-3（1∶1 000）或COX-2（1∶1 000）或β-actin（1∶2 500）一抗孵育，4℃过夜，加标记辣根过氧化物酶的抗鼠/兔IgG二抗，常温孵育1 h，然后用ECL发光，X线胶片曝光成像，TotalLab软件进行图像分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尼美舒利对Hela细胞增殖的抑制作用

100～800 μmol/L尼美舒利作用Hela细胞24、48和72 h后，可显著抑制细胞的生长，见图1。对照组（0 μmol/L组）宫颈癌Hela细胞抑制率在观察期内始终处于本底水平，而浓度为100、200、400和800 μmol/L的尼美舒利作用24～72 h后Hela细胞抑制率显著升高，药物作用浓度、作用时间与细胞抑制率之间呈现明显的剂量-效应和时间-效应关系。

2.2 尼美舒利对Hela细胞显微及超微结构的影响

2.2.1 显微结构改变 见图2。对照组Hela细胞呈梭形或多角形，单层生长良好，数量多，胞间接触紧密（图A）。而经400 μmol/L尼美舒利处理的Hela细胞，数量明显减少，细胞膜鼓起，体积缩小，细胞固缩，胞间隙增大，附壁能力显著下降，呈悬浮状，胞浆透亮度下降，呈颗粒感（图B）。200 μmol/L尼美舒利处理组细胞改变较400 μmol/L组轻，只有部分脱壁固缩（图C）。

A：对照组；B：400 μmol/L尼美舒利组； C：200 μmol/L尼美舒利组

2.2.2 超微结构改变 对照组细胞表面微绒毛丰富，胞浆均匀，较多细胞器分布，空泡少，细胞核大且染色质呈均匀斑点状分布，胞质中糖原颗粒及线粒体较多见。400 μmol/L尼美舒利作用后，细胞表层微绒毛减少，核呈不规则状，核内染色质凝集成块，可见凋亡小体，个别细胞呈空化状，线粒体肿胀，嵴断裂，少数细胞膜破坏，细胞器溢出。见图3。

2.3 尼美舒利对Hela细胞COX-2表达的影响

为了探讨尼美舒利的抑制肿瘤细胞的机制，笔者研究了COX-2蛋白的表达变化，见图4。由图4可知，COX-2在尼美舒利作用24、48和72 h后，表达水平与空白对照组相比均显著下降（P < 0.05、P < 0.01），且其变化趋势与作用时间均呈现明显的时间-效应关系。

2.4 尼美舒利对Hela细胞Caspase-3的表达的影响

为了进一步探讨尼美舒利的抗肿瘤机制，笔者研究了细胞凋亡通路关键蛋白Caspase-3的表达变化。尼美舒利对Hela细胞Caspase-3的表达的影响结果见图5。由图5可知，Hela细胞在药物作用24、48和72 h后，Caspase-3的表达水平与空白对照组相比分别上升了约1.2、1.5和2.5倍（P < 0.01）。

3 讨论

尼美舒利是一种新型的非甾体类抗炎药，对COX-2的抑制具有高选择性，长期服用无明显肾或胃肠道副作用。大样本人群的回顾性研究表明，绝经妇女定期服用非甾体抗炎药5～9年和10年以上，乳腺癌发生率分别下降21%和28%[8]，也有研究认为，服用非甾体抗炎药与降低女性癌变的发生风险之间并无统计学上的联系[9]。基于此，探讨非甾体抗炎药抗癌的机制具有重要意义。

本实验通过观察尼美舒利对人宫颈癌hela细胞株的抑制作用，探讨了其对人宫颈癌细胞抑制作用以及相关机制。MTT检测结果及细胞纤维形态学改变均表明，尼美舒利可显著抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖，超微结构中可见凋亡小体及细胞器损伤，这表明尼美舒利可诱发肿瘤细胞的凋亡或坏死。

COX-2可通过前列腺素参与调控癌细胞生长与分化，同时，COX-2可抑制细胞凋亡[10]。尼美舒利抑癌机制可能与抑制COX-2的活性，进而促发癌细胞凋亡的发生有关。研究表明，尼美舒利还可通过减少慢性炎症中超氧化物、8-羟基-脱氧鸟苷酸的产生，促进细胞的凋亡[11]。本研究结果显示，尼美舒利作用后，COX-2表达水平显著降低，这可能在一定程度上促进了肿瘤细胞的凋亡。

细胞凋亡在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的生物学意义，很多化疗药物都是通过诱导癌细胞的凋亡进而发挥抑制肿瘤的作用[12]。细胞凋亡是由Caspase家族介导的蛋白酶级联反应过程，不同的细胞或不同信号转导途径诱发的凋亡过程参与的Caspase也不尽相同，而Caspase-3是凋亡的关键酶和执行者，是所有细胞凋亡蛋白酶级联反应的“公共通路”，被称为“死亡蛋白”。本研究的结果表明，尼美舒利可以诱发Hela肿瘤细胞中凋亡关键蛋白Caspase-3的表达水平显著升高，且药物作用时间与Caspase-3表达水平之间均呈现明显的时间-效应关系。

综上所述，尼美舒利具有明确的抑制宫颈癌Hela细胞的作用，其机制之一可能是通过抑制COX-2表达引发肿瘤细胞的凋亡。尼美舒利是一种具有临床应用价值的抗宫颈癌药物，对其作用机制和在体抗肿瘤活性作用仍需深入探索。该研究对拓展抗宫颈癌药物研究思路、寻找新的抗癌作用靶点具有重要的理论和实践意义。

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（收稿日期：2012-10-15 本文编辑：谷俊英）