荞麦茶中黄酮含量测定的三种比色法比较
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摘要：对国内外3种常用的比色法测定荞麦茶中总黄酮含量进行了比较，结果表明，NaNO2-AlCl3-NaOH显色法是荞麦茶总黄酮含量测定的最适方法，该方法稳定性好，操作简便。
关键词：荞麦茶；黄酮；比色法测定方法
中图分类号：Q946.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3744-03
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.15.042
Abstract：In order to study measuring method of flavonoids in buckwheat tea， three of the most popular colorimetric methods are compared in this study. The results showed that the NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetric method is the optimum method to measure flavonoids content of buckwheat tea. And this method was convenient， accurate， and reproducible.
Key words： buckwheat tea； flavonoids content； measuring method
黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用[1]。近年来，随着人类对健康的关注度越来越高，以荞麦为主要原料的保健品的开发速度也越来越快，荞麦茶、荞麦馒头、荞麦饼干等[2]逐步出现在市场，其中由于荞麦茶具有味道鲜美、储存方便等优点，深受人们的喜爱。
黄酮类化合物在植物界中分布广泛，它们常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。目前已发现有6 000多种不同的黄酮类化合物[3]，因此对植物中的黄酮含量进行精确测量难度很大。但是黄酮类化合物具有邻二酚羟基或3，5位羟基结构，可与铝盐、铅盐、镁盐等金属盐类试剂反应，生成有色络合物，可用可见分光光度法测定其含量。目前黄酮测定的分光光度法主要有NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法、AlCl3-KAc显色法和NaNO2-AlCl3-NaOH显色法3种，本研究用这3种常用的比色法测定荞麦茶总黄酮含量，以期确定最适于荞麦茶中总黄酮含量测定的方法，为荞麦的合理开发利用提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
荞麦茶购自西昌市正中食品有限公司；芦丁标准品购自贵州迪大生物有限公司（纯度≥98.5%）；其他试剂为分析纯。
DHG-90A（101AB）型干燥箱（上海索谱仪器有限公司）；UV-5300紫外可见分光光度计（上海元析公司）；AR1140型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；WB-400型小型高速粉碎机（北京维博创机械设备有限公司）；TDL-5C型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AKJY-20超纯净水机（艾柯仪器公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；PHS-3C型酸度计（上海虹仪仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 3种测定方法的波长扫描 ①AlCl3-KAc显色法。AlCl3-KAc显色法参考文献[4]，并稍作改动。准确吸取提取液1 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl3 2 mL、1 mol/L KAc 3 mL，最终用甲醇溶液定容至10 mL，摇匀，室温下放置30 min。在4 000 r/min下离心10 min，在200～1 000 nm内进行扫描，根据最大吸收峰确定测定波长。②NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法参照文献[5]，并稍作改动。准确吸取提取液1 mL，依次加入2 mL去离子水、0.5 mL 5%NaNO2溶液混合，振荡后放置6 min，加入0.5 mL 10% Al（NO3）3溶液，振荡后放置6 min，然后加入2.5 mL 5% NaOH溶液，振荡后放置15 min，最后用去离子水定容至9 mL，在200～1 000 nm内进行扫描，根据最大吸收峰确定测定波长。③NaNO2-AlCl3-NaOH显色法。NaNO2-AlCl3-NaOH显色法参照文献[6]，并稍作改动。准确吸取提取液1 mL，依次加入3 mL去离子水、0.3 mL 5% NaNO2溶液混合，振荡后放置5 min，加入0.3 mL 10% AlCl3溶液，振荡后放置6 min，然后加入2.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，振荡后用去离子水定容至10 mL，在200～1 000 nm内进行扫描，根据最大吸收峰确定测定波长。
1.2.2 3种测定方法的稳定性比较 样品和对照品依次使用AlCl3-KAc显色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法、NaNO2-AlCl3-NaOH显色法加入试剂，进行600 s的连续吸光度测定，试剂添加完毕后，进行600 s的连续吸光度测定，测定间隔设定为0.5 s。对照品不添加显色剂，其他试剂与样品测定时添加的相同，将样品在600 s的吸光度减去对照相应的值，绘制3种测定方法在600 s内吸光度变化曲线，并运用SPSS 17.0对3种方法获得的吸光度进行统计分析，对比3种方法的优劣。
2 结果与分析
2.1 3种测定方法的波长扫描结果
通过对3种测定方法进行的波长扫描（图1-图3），AlCl3-KAc显色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法、NaNO2-AlCl3-NaOH显色法最大吸收峰对应的波长分别为419、509、507 nm。
2.2 3种测定方法的稳定性比较
由图4-图6知，3种方法使用的对照品在600 s内均较稳定，获得的吸光度变化较小，表明不添加显色剂，其他试剂照常加入的对照方法是可靠的。将3种方法样品吸光度减去相应对照的吸光度获得最终的测量值，由图7可知，NaNO2-AlCl3-NaOH显色法在600 s内吸光度的标准误差、标准差、方差等指标上均优于其他两种方法（表1），可见、荞麦茶总黄酮含量测定最适方法为NaNO2-AlCl3-NaOH显色法。
3 小结与讨论
用3种常用的黄酮测量分光光度法测定荞麦茶中总黄酮，并进行了3种方法的比较，结果表明，NaNO2-AlCl3-NaOH显色法是荞麦茶总黄酮含量测量的最适方法，与此前报道[7]的AlCl3-KAC显色法是金荞麦叶总黄酮含量测定的最适方法差异较大，这可能的原因是两个研究用到的材料分别为苦荞麦和金荞麦，这两个材料所含的黄酮类化合物种类不同，同时荞麦茶在加工过程中有部分黄酮类化合物分解或者转化，而剩下的荞麦茶黄酮类化合物比较适应NaNO2-AlCl3-NaOH显色法的测量环境所致，至于荞麦在加工成荞麦茶后，荞麦茶的黄酮类化合物类型的确定，需要进一步的分离提纯鉴定。
参考文献：
[1] 延 玺，刘会青，邹永青，等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].有机化学，2008，28（9）：1534-1544.
[2] 刘光德，李名扬，祝钦泷，等.资源植物野生金荞麦的研究进展[J].中国农学通报，2006，22（10）：380-389.
[3] 董娟娥，张康健，梁宗锁.植物次生代谢与调控[M].陕西杨凌：西北农林科技大学出版社，2009.
[4] NY/T 1295-2007，荞麦及其制品中总黄酮含量的测定[S].
[5] 杨 磊，贾 佳，祖元刚.山楂属果实提取物的体外抗氧化活性[J].中国食品学报，2009，9（4）：28-32.
[6] JIA Z S，TANG M C，WU J M. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals[J].Food Chemistry，1999，64：555-559.
[7] LI G，YU S，ZHOU Y H， et al. Spectrophotometric determination of flavonoids content in leaves of fagopyrum cymosum complex[J]. Asian Journal of Chemistry，2013，25（13）：7575-7578.