商品化培养液对人类胚胎发育及妊娠结局的影响
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[摘要] 目的 比较两种商品化序贯培养液Cook和Vitrolife对人类胚胎发育潜能及妊娠结局的影响。 方法 回顾性分析2014年8月～2015年5月于南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心行体外受精（IVF）或卵胞浆内单注射（ICSI）的398例患者的临床资料。根据受精方式与胚胎培养液不同进行分组，IVF周期分为Cook组（n = 103例）和Vitrolife组（n = 196例），ICSI周期分为Cook组（n = 40例）和Vitrolife组（n = 59例）。比较同一受精方式下两种培养液组的受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率、临床妊娠率、胚胎种植率和早期流产率。 结果 IVF和ICSI周期中，Cook组受精后第3天可利用胚胎率均显著低于Vitrolife组（31.22%比40.61%，33.43%比42.34%，P < 0.05），而可利用囊胚率均显著高于Vitrolife组（55.42%比37.82%，46.39%比30.58%，P < 0.05）。受精后第3天胚胎发育速度方面，Cook组5～7个细胞的胚胎所占比例显著高于Vitrolife组（34.32%比24.23%，P < 0.05），而Vitrolife组8～10个细胞的胚胎所占比例显著高于Cook组（52.22%比42.07%，P < 0.05）。 结论 Vitrolife培养液和Cook培养液对妊娠结局并无显著影响，但Cook培养液可能更有利于囊胚阶段的发育。
[关键词] 胚胎；培养液；培养发育；妊娠结局
[中图分类号] R321 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（b）-0072-04
[Abstract] Objective To compare the influence of two commercially sequential media Cook and Vitrolife on development potential of human embryos and the clinical pregnancy outcome. Methods Clinical data of 398 patients conceived through IVF or ICSI from August 2014 to May 2015 in the Reproductive Medicine Center of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School were retrospectively analyzed， and according to fertilization methods and embryo culture media they were divided into Cook group （103 cases） and Vitrolife group （196 cases） in IVF； while Cook group （40 cases） and Vitrolife group （59 cases） in ICSI. In the same fertilization mode， the rate of fertilization， normal fertilization， cleavage， avaiable embryo， blastocyst formation， avaiable blastocyst， clinical pregnancy， embryo implantation and early abortion in the Vitrolife group and Cook group were compared. Results In IVF and ICSI cycles， the available embryo rate of the 3 days after fertilization in Cook group was lower than that in the Vitrolife group （31.22% vs 40.61%， 33.43% vs 42.34%， P < 0.05）. While， the available blastocyst rate in the Cook group was significantly higher than that of the Vitrolife group （55.42% vs 37.82%， 46.39% vs 30.58%， P < 0.05）. 3 days after fertilization， the proportion of 5-7 cells of the embryo in the Cook group was significantly higher than that in the Vitrolife group （34.32% vs 24.23%， P < 0.05）； and the proportion of 8-10 cells of the embryo in the Vitrolife group was significantly higher than that in the Cook group （52.22% vs 42.07%， P < 0.05）. Conclusion There is no significant effect on pregnancy outcome either in Vitrolife culture medium or Cook culture medium， but the Cook culture medium may be better for the development of blastocyst stage.
[Key words] Embryo； Culture media； Embryonic development； Pregnancy outcome
人类胚胎培养液经历了30多年的发展，如今市场上已出现多种有效的商品化培养液用于胚胎培养。不同品牌的培养液有不同类型及不同浓度的营养成分，同时由于人类配子的稀缺性、珍贵性，商品化培养液的配制更多是基于动物实验结果验证。而人类配子对营养成分的需求和体外微环境的适应性与动物配子又有一定差距[1]，因此不同培养体系可能会对植入前胚胎的发育潜能以及种植能力产生一定影响，进而导致新生儿早产、低体重以及先天性畸形等子代健康问题[2-7]。造成差异的原因尚未明确，如何选择更适用于人类胚胎的商品化培养液已成为很多生殖中心工作人员需要考虑的问题。目前，很少有研究比较这些商品化培养液对种植前人类胚胎的发育潜能及妊娠结局的影响。因此，本研究就Vitrolife和Cook两种商品化培养液对胚胎的发育速度等发育潜能相关指标及妊娠结局的影响进行深入探讨。
1 对象与方法
1.1 对象
回顾性分析2014年8月～2015年5月在南京大学医学院附属鼓楼医院（以下简称“我院”）生殖科行常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞浆内单注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗并新鲜周期移植的398例患者的临床资料。纳入标准：①女方年龄≤35岁；②不孕年限< 10年；③第1周期患者；④采用长方案治疗；⑤体重指数（BMI）18～25kg/m2；⑥内膜厚度8～12 mm；⑦月经第3天卯泡刺激素（FSH）≤12 U/mL；⑧获卵数8～15枚。排除标准：①种植前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）周期；②供精；③受精失败行早期补救ICSI周期。根据受精方式与胚胎培养液的不同进行分组：IVF周期分为Cook组（n = 103例）和Vitrolife组（n = 196例），ICSI周期分为Cook组（n = 40例）和Vitrolife组（n = 59例）
1.2 控制性超促排卵方案
采用促性腺激素（Gn）释放激素激动剂（GnRh-a，曲普瑞林，德国Ferring公司）/基因重组促卵泡激素（Gonal F，果纳芬，瑞士雪兰诺公司）/人绒毛膜促性腺激素（HCG）长方案进行控制性超排卵[8]。当主导卵泡直径≥18 mm，给予HCG。当主导卵泡直径≥18 mm，给予HCG。
1.3 卵子采集及胚胎培养
取卵当日，卵泡穿刺获得卵子-放射冠-卵丘复合物（OCCCs），置于受精培养液（IVF（Vitrolife，Sweden；FM，COOK，Sydney）中培养3 h，卵母细胞经IVF或ICSI进行受精，受精后转移至卵裂培养液（G1，Vitrolife，Sweden；CM，COOK，Sydney）。受精后第3天除移植与冷冻胚胎外，剩余胚胎转移至囊胚培养液（G2，Vitrolife，Sweden；BM，COOK，Sydney）继续培养，于第5～6天分别观察囊胚发育情况。
1.4 胚胎评估
根据ALPHA/ESHRE指南对胚胎质量进行分级评估[9]，其中分裂期胚胎根据细胞数、卵裂球均一程度、碎片等形态学参数进行质量评估，分裂胚细胞数7～12个，碎片小于20%，均一或轻度不均为可利用胚胎；囊胚质量根据囊胚的扩张和孵出程度将其分为Ⅰ～Ⅵ级，并依据内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养层（trophectoderm，TE）的质量分为A～C级，ⅣCB和ⅣBC以上评分者为可利用囊胚[10]。
1.5 移植与妊娠
受精后第3天于B超引导下进行宫腔内双分裂期胚胎移植。胚胎移植后2周留晨尿行尿HCG检测，阳性结果确定为生化妊娠。移植后4周行B超检查，见妊娠囊者确诊为临床妊娠。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者的一般资料
IVF组与ICSI组中，患者的周期数、年龄、不孕年限、体重指数、内膜厚度、基础FSH、黄体生成素（LH）用量、平均获卵数比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.2 IVF/ICSI周期中Cook与Vitrolife培养液对胚胎发育及妊娠结局的影响
IVF/ICSI周期中，Cook组的第3天可利用胚胎率显著低于Vitrolife组，而囊胚形成率及可利用囊胚率显著高于Vitrolife组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。两组受精率、正常受精率、异常受精率、卵裂率、正常卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率、种植率及早期流产率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表2。
2.3 不同培养液对取卵后第3天胚胎发育速度的影响
对取卵后第3天胚胎的发育速度进行分析（Cook组共1716枚分裂胚，Vitrolife组共2922枚分裂胚）。Cook组5～7个细胞的胚胎所占比例显著高于Vitrolife组，而Vitrolife组8～10细胞的胚胎所占比例显著高于Cook组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；Vitrolife组≥11个细胞和Compacting的胚胎所占比例均略高于Cook组，≤4个细胞略低于Cook组，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
3 讨论
国际辅助生殖技术监督委员会（ICMART）和欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）的统计数据显示，通过辅助生殖技术受孕的孩子逐年增多，但其安全性还需进一步验证[11-12]。植入前胚胎在体外培养过程中将经历从受精至内细胞团和滋养外胚层等不同细胞谱系的派生等过程，体外培养液可能会导致这些关键性事件发生改变进而可能会影响胚胎的后续发育[13-14]。基于我院中心实验室的培养体系，本研究结果显示：Cook和Vitrolife两种商品化培养液均可获得较为理想的可利用胚胎和妊娠结局，但Cook组的第3天可利用胚胎率显著低于Vitrolife组，而囊胚形成率及可利用囊胚率显著高于Vitrolife组。
不同品牌的培养液其营养成分及含量均会有差异，Morbeck等[15]利用小鼠冻融后的一细胞胚胎分别在七种商品化序贯培养液中进行培养，其结果表明：7种培养液的营养成分各有差异，其中Vitrolife培养液的G1和G2中的乳酸含量为10.8和6.0 mmol/L，明显高于Cook培养液（1.8 mmol/L）；Vitrolife分裂期培养液G1不含必需氨基酸，而Cook分裂期培养液CM中含有一定量的必需氨基酸。此外，7种培养基在不同的氧气浓度和蛋白含量下，鼠胚发育速度和囊胚形成率也有差别。
本研究结果提示，分裂期培养阶段，Vitrolife培养液优于Cook培养液，而进入囊胚培养阶段，Cook培养液呈现出了明显优势。于是本研究对第3天胚胎的发育速度进行了比对，结果显示，Cook组中≤7个细胞的胚胎所占比例较Vitrolife组高，而≥8个细胞的胚胎Cook组所占比例较Vitrolife组少，说明Cook于分裂期发育速度慢于Vitrolife，而7个细胞以下的胚胎于第3天不会作为可利用胚胎，因此Cook组第3天可利用胚胎率会低于Vitrolife组。这一结论是否能说明G1优于CM，BM优于G2，仍需进一步研究。此外，Vitrolife组异常受精率（13.96%）略高于Cook组（11.00%），其原因可能由于过高的多精受精率会降低可利用胚胎率[16-17]，因此Cook培养液的正常受精率比例有所提高，使正常胚胎数略有增加。
在辅助生殖治疗过程中，胚胎培养液是种植前胚胎最直接的接触环境，胚胎可能通过表观遗传学修饰做出一些适应性改变，产生长期持续性影响[18-21]。Rinaudo等[22]发现鼠胚在Whitten′s medium中有114个基因表达被影响，在KSOM/AA中有29个基因表达被影响。而与在体内培养的鼠胚相比，5种不同培养液培养的鼠胚为了维持基因印记会做出不同的表观遗传学改变[23]。鉴于以上动物实验结果及试管婴儿逐年增加的趋势，应优化胚胎培养液的选择，以降低胚胎的短期风险，保障母婴安全。
本次研究对象均是35周岁以下，使用长方案促排的患者，其卵巢功能较好，获卵数适中，因此研究对象范围有局限性。在今后的临床工作中，本研究将比较不同培养液对年龄较大、卵巢功能较差的患者，以及对获卵数过多或过少的患者的胚胎发育状况的影响。同时，本研究还将对新生儿出身状况及长期健康情况进行随访，以确保商品化培养液的安全可靠。
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（收稿日期：2016-06-07 本文编辑：任 念）