虫草菌丝粉粗多糖含量测定方法研究

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摘 要：本文以虫草菌丝粉为材料，比较了超声提取与沸水浴提取对虫草粗多糖得率的影响，以及水浴时间、沉淀多糖的乙醇浓度、醇沉时间对粗多糖得率的影响。研究结果表明沸水浴提取较超声提取粗多糖得率高，水浴时间应控制在5h左右为宜，乙醇浓度宜选择100%，时间应为6h左右为宜。

关键词：虫草；菌丝；多糖测定

中图分类号：R284 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160632008

虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，虫草多糖是由甘露糖、虫草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、岩藻糖组成的多聚糖。本文从以下几个方面对虫草多糖测定方法进行了粗浅的摸索：超声提取与沸水浴提取的比较；沸水浴时间不同对粗多糖提取得率的影响；不同浓度的乙醇沉淀粗多糖对多糖得率的影响；醇沉不同时间对粗多糖得率的影响。现将实验结果总结如下：

1 材料和方法

1.1 材料

虫草菌丝粉，购自西安双德生物有限公司。

1.2 试剂

葡萄糖（中国食品药品检定研究院）、乙醇、硫酸（固安新欣化工有限公司）、苯酚（天津大学科威公司）。

1.3 仪器

超声波清洗器、恒温水浴锅、岛津UV2550紫外分光光度计、离心机。

1.4 供试品溶液的制备

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，加水80 mL，超声或100℃热水浸提，加水定容至100 mL，过滤后收集滤液，取滤液5mL，加4倍体积的乙醇，4℃静置，离心收集沉淀，准确加入25 mL水溶解沉淀。

1.5 粗多糖的测定――苯酚硫酸法[3]

1.5.1 标准曲线的制备

精密吸取浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，各加蒸馏水使体积为1.0mL，再加苯酚溶液（5%）1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，振荡摇匀后置沸水浴中加热15min，取出具塞试管，迅速冷却至室温，在490nm波长处测定吸光度。同时以蒸馏水如上法配制空白液。以葡萄糖标准液中葡萄糖的绝对质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程。

1.5.2 样品溶液测定

吸取按1.4方法制备的供试品溶液适量，置于10mL具塞试管中，按1.5.1法自“各加蒸馏水使体积为1.0mL，……”至“……在490nm波长处测定吸光度”操作，测定供试品溶液吸光度，根据标准曲线所确定的回归方程，计算供试品溶液中粗多糖的含量。

2 结果

2.1 超声不同时间对粗多糖提取率的影响

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，加水80mL，超声20min、40min、60min、90min后过滤，滤液加4倍无水乙醇，4℃静置6h后，离心收集沉淀，准确加入25mL水溶解沉淀。采用苯酚硫酸法分别测定粗多糖含量（结果如表1）。

从表1可知，超声60min，所提取的粗多糖含量达到最大值，随着超声时间的延长，含量增加幅度不大，并且有减小的趋势。原因可能是由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而影响多糖得率[4]。故采用超声提取粗多糖时，超声时间选择在60min为宜。

2.2 100℃热水浸提不同时间对粗多糖提取率的影响

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，加水80 mL，100℃热水中浸提1h、2h、3h、5h、8h，滤液加4倍无水乙醇，4℃静置6h后，离心收集沉淀，准确加入25mL水溶解沉淀。采用苯酚硫酸法分别测定粗多糖含量（结果见表2）

从上图可知，热水浸提5h，粗多糖得率达到最大值，随着水浴时间的延长，得率增加缓慢，故从节省检测时间及节约能源角度考虑，采用水浴浸提，时间应控制在5h左右为宜。

2.3 醇沉不同时间对粗多糖提取率的影响

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，100℃热水中浸提5h后，滤液加4倍无水乙醇，4℃静置2h、4h、6h、8h、12h后，离心收集沉淀，准确加入25 mL水溶解沉淀。采用苯酚硫酸法分别测定粗多糖含量（结果见表3）。

从上图可知，随着沉淀时间的延长，粗多糖的得率增加，无水乙醇沉淀6h后，得率增加缓慢，故乙醇沉淀时间选择在6h为宜。

2.4 醇沉浓度对粗多糖提取率的影响

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，100℃热水中浸提5h后，滤液加4倍体积的浓度分别为60%、85%、95%、100%乙醇，4℃静置6h后，离心收集沉淀，准确加入25mL水溶解沉淀。采用苯酚硫酸法分别测定粗多糖含量（结果如表4）。

从表4可知，乙醇浓度在100%，粗多糖得率最高，随着乙醇浓度的减少，得率下降。故醇沉浓度应选择在100%为最佳。

2.5 显色稳定性

取虫草菌丝粉约1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，100℃热水中浸提5h后，滤液加4倍无水乙醇，4℃静置6h后，离心收集沉淀，准确加入25 mL水溶解沉淀。采用苯酚硫酸法，加入规定量苯酚、硫酸显色，每隔30min测定吸光度。结果见下表：

从表5可知，供试品溶液加入规定量的苯酚、硫酸显色后，在2h内测定，粗多糖含量结果较为稳定。

3 结论

由上述实验结果可知，在进行虫草菌丝体粗多糖提取时，超声提取虽然较沸水浴提取节省时间，但前者粗多糖得率比后者低很多，故沸水浴提取应为虫草菌丝体粗多糖提取的首选方法。从节省检测时间及节约能源角度考虑，沸水时间应控制在5h左右为宜。在对粗多糖进行沉淀时，乙醇浓度宜选择无水乙醇，时间控制在6h左右为宜。

参考文献

[1]戴小军，柳冬梅，孟霞.冬虫夏草抗癌作用研究现状[J].贵州农业科学，1990（3）：53-58.