奥硝唑栓微生物限度检查方法的验证
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1、实验材料
1.1仪器HTY-2000A薄膜过滤器, 杭州泰林科技有限公司。
1.2试剂氯化钠(分析纯),上海化学试剂厂吐温80 (分析纯) , 上海化学试剂厂。
1.3 稀释剂及培养基: 改良马丁培养基(0508222)胆盐乳糖培养基(050921)
营养肉汤培养基(040329)营养琼脂培养基(051009)玫瑰红钠琼脂培养基(050302)pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(0511162)7.5%氯化钠肉汤培养基(040220),以上培养基均由中检所提供。
1.4 试验用菌株名称及其编号
2、实验方法
2.1菌液制备及供试液的制备
2.1.1菌液的制备
取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌营养肉汤培养物1ml分别加入9ml 0.9%的氯化钠溶液中,10倍依次稀释,金黄色葡萄球菌至10-6,大肠埃希菌至10-7,枯草芽孢杆菌至10-5,铜绿假单胞菌10-7至约为10～100cfu/ml,备用。
取经23～28℃培养24～48小时的白色念珠菌真菌液体培养物1ml,加入9ml 0.9%的氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5,约为10～100cfu/ml备用。
取经培养5～7天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,加入3ml 0.9%的氯化钠溶液,洗下孢子转移至另一试管,取1ml加入9ml 0.9%的氯化钠溶液中,10倍稀释至10-4,约为10～100cfu/ml备用。
2.1.2 供试液的制备
取本品10g,加入6ml无菌的聚山梨酯80,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀,作为1:10供试液。
2.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证过程
2.2.1试验组:
吸取1:10供试液,加适量冲洗液于无菌滤器中以湿润滤膜,分取1ml上述供试液于无菌滤器中,过滤,用保温45℃左右冲洗液冲洗。总冲洗量为400ml(每筒),最后一次冲洗时分别加入已制备好的金黄色葡萄菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液1ml,取出滤膜,菌面朝上,金黄色葡萄菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的滤膜,分别贴于营养琼脂培养基平板上,30～35℃培养48小时。
吸取1:10的供试液各1ml于无菌平皿上,分别加入白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液1ml,立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml,23～28℃培养72小时。
2.2.2菌液组:
加适量冲洗液于无菌滤器中以湿润滤膜,分别加入已制备好的金黄色葡萄菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液1ml,用适量冲冼液冲洗,取出滤膜,菌面朝上,贴于营养琼脂培养基平板上,30～35℃培养48小时。
吸取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1ml于无菌平皿上 ,立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml,23～28℃培养72小时。
2.2.3供试品对照组:
细菌对照组:取1:10的供试液1ml,方法同试验组,不加菌悬液。
霉菌及酵母菌对照组:取1:10的供试液各1ml于无菌平皿上,立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml,23～28℃培养72小时。
2.2.4稀释液对照组:用稀释液代替供试液,方法同试验组。
2.3控制菌检查方法的验证
2.3.1金黄色葡萄球菌
试验组:检验方法同上。总冲洗量为400ml,最后一次冲洗时加入已制备好的金黄色葡萄球菌菌液1ml,取出滤膜,置于100ml7.5%氯化钠肉汤培养基,35～37℃24培养小时(必要时可延长至48小时)。取上述增菌培养液,以接种环沾取1-2环培养液,划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上,置36℃±1℃培养24～72小时后观察。
阴性对照组:方法同试验组,用1ml大肠埃希菌菌液代替金黄色葡萄菌菌液,即得。
2.3.2铜绿假单孢菌
试验组:检验方法同上。总冲洗量为200ml,最后一次冲洗时加入已制备好的铜绿假单孢菌菌液1ml,取出滤膜,置于100ml胆盐乳糖培养基中,35～37℃18～24培养小时。取上述增菌培养液,以接种环沾取1～2环培养液,划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂平板上,置36℃±1℃培养18～24小时后观察。
阴性对照组:方法同试验组,用1ml大肠埃希菌菌液代替铜绿假单孢菌菌液,即得。
3、结果
从表1、表2中可以看出,3 次独立的平行试验中, 所有验证用微生物均能在产品试验组中生长良好,并且稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 和试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 均不低于70 %。说明奥硝唑栓微生物限度检查不存在抑制微生物生长的因素。因此,可按照此检验方法和检查条件进行检查 。
4、结论
奥硝唑栓为第三代硝基咪唑类衍生物,含有较强的抑菌力, 其微生物限度检查采用薄膜过滤法,以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液,冲洗量为400ml,即可消除样品对各菌株的抗菌活性, 此检验方法, 作为含抑菌成分药物的检验方法。