E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的鉴定
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摘要：目的 鉴定e3泛素连接酶 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，hectd3） 基因的真核表达质粒。方法 提取无内毒素真核表达质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3细胞，qRT-PCR法和蛋白质免疫印迹技术检测该基因的表达情况。结果 真核表达质粒pcDNA-HECTD3可以显著地提高HECTD3基因在mRNA和蛋白水平的表达量。结论 HECTD3基因的真核表达质粒构建成功，可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。
关键词：E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶[2]。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[3]，但尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。实验室前期构建该基因真核表达质粒pcDNA-HECTD3，本研究将鉴定该真核表达质粒在胞内对HECTD3基因表达情况的影响，为进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。
1实验材料
卵巢癌细胞SKOV-3和真核表达质粒pcDNA-HECTD3由本室保存。Trizol、Lipofectamine 2000购自美国invitrogen公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。逆转录试剂盒cDNA Synthesis Kit （M-MLV Version）、SYBRRPremix Ex Taq II（Ti RNaseH Plus）购自TaKaRa公司。Endo-free Plasmid Extraction Kit II购自omega公司，细胞裂解液购自碧云天，蛋白酶抑制剂cocktail购自Roche公司。Anti-HECTD3鼠多抗、anti-β-actin鼠单抗、辣根过氧化酶偶联的鼠二抗购自abcam公司，ECL化学发光试剂盒购自millipore公司。引物由invitrogen公司合成。
2实验方法
2.1 qRT-PCR 提取无内毒素质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3，24 h后提取细胞总RNA，并将其逆转录为cDNA，此为qRT-PCR模板。内参Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）上游引物序列：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'，下游引物：5'- TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'；HECTD3的上游引物：5'- CAGGCAGGTCTGCTGAAGGT-3'，下游引物：5'-CGAGTCAGATGGCTCGAAGT
C-3'。qRT-PCR反应体系如下：SYBR 10 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，DNA模板 100 ng，用双蒸水补至20 μL体积。qRT-PCR反应条件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s（40个循环）40℃ 1 min。实验重复3次，用SPSS 19.0软件包进行统计学分析。
2.2蛋白质免疫印迹 提取无内毒素质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3，48 h后提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后电转移至PVDF膜上，置于5% 脱脂奶粉中室温封闭2 h，室温孵育一抗2 h （HECTD3，1∶500；β-actin，1∶5000），TBST洗3次×15 min，分别加入辣根过氧化酶偶联的鼠二抗（1∶10000），室温孵育1 h，TBST洗3次×15 min，化学发光试剂盒ECL显色。
3实验结果
利用qRT-PCR技术检测HECTD3在卵巢癌细胞中的mRNA水平的表达情况，见图A。由图可以看出，转染了表达质粒pcDNA-HECTD3的细胞中HECTD3在mRNA水平的表达量是对照组的3.489倍，且P
HECTD3在mRNA水平和蛋白水平的表达情况（A）将质粒转染至SKOV-3中，24 h后检测HECTD3基因在mRNA水平的表达情况，**表示P
4讨论
利用酵母双杂交技术Yu J等人发现了一个新的E3泛素连接酶HECTD3基因[4]。有学者通过免疫共沉淀技术发现HECTD3可能参与了神经元的发 育[5]。Li Y等报道在乳腺癌和宫颈癌细胞中抑制E3泛素连接酶HECTD3表达后能促使癌细胞对顺铂增敏[3]。目前尚未有在卵巢癌中研究HECTD3基因功能的报道，因此本研究首先在体外卵巢癌细胞中验证了该基因真核表达的情况。在后续的研究中，我们将构建稳定表达HECTD3基因的SKOV-3细胞系，同时深入探讨体外过表达该基因所引起的一些列细胞学变化及其具体的分子机制。
参考文献：
[1]Jemal A，Bray F，Center M M， et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.
[2]Mattern M R， Wu J， Nicholson B.Ubiquitin-based anticancer therapy： carpet bombing with proteasome inhibitors vs surgical strikes with E1， E2， E3， or DUB inhibitors[J].Biochim Biophys Acta，2012，1823（11）：2014-2021.
[3]Li Y， Chen X， Wang Z，et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1[J].Neoplasia，2013，15（1）：39-48.
[4]Yu J， Lan J， Zhu Y， et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，367（4）：805-812.
[5]Zhang L， Kang L， Bond W， et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3， a HECT domain ligase[J]. Cell Mol Neurobiol，2009，29（1）：115-121.