骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响

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[摘要]　目的　探讨骨桥蛋白（osteopontin，OPN）基因对大肠癌细胞侵袭的影响及机制。　方法　以人大肠癌Colo　205细胞为模型，应用OPN基因小干扰RNA（small　interfering　RNA，siRNA）转染处理后，采用荧光实时定量PCR检测OPN基因　mRNA水平，采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖能力，采用Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力，采用蛋白质印迹检测癌细胞akt磷酸化水平。　结果　OPN转染组癌细胞OPN　mRNA和蛋白水平明显被抑制，且与时间和浓度相关。与空白对照组比较，OPN转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。蛋白质印迹检测发现，OPN转染组细胞Akt磷酸化水平明显下调。　结论　OPN基因转染可明显下调大肠癌细胞的增殖和恶袭能力，下调Akt磷酸化水平，是OPN基因转染下调癌细胞的增殖和恶袭能力重要机制之一。

[关键词]　大肠肿瘤；骨桥蛋白；侵袭；Akt；磷酸化

[中图分类号]　R735.3+4 [文献标识码]　A [文章编号]　1673-7210（2012）12（b）-0055-03

大肠癌（包括结肠癌和直肠癌）近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白（osteopontinin，OPN）与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月～2012年6月，本课题组借助于RNA干扰（RNA　interference，RNAi）技术，以大肠癌Colo205细胞为模型，对其采用OPN基因小干扰RNA（small　interfering　RNA，siRNA）转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路（Akt）方面探讨了分子机制。

1　材料与方法

1.1　材料

人大肠癌细胞Colo　205购自美国ATCC公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN基因siRNA的正义链序列：GAA　ACU　CCC　UGU　AAA　CUA　A　dTdT；反义链序列：UAA　GUU　UAC　AGG　GAG　UUU　C　dTdT，由美国Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗体购自美国Santa　Cruz公司。其他RNA提前试剂（Trizol，RNase抑制剂），和逆转录试剂（SSRTⅡ、Taq　酶）及转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。

1.2　细胞培养及转染处理

人大肠癌Colo　205细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将浓度为1.0×105/mL的细胞接种于24孔培养板24　h后，待细胞长满60%～70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组（Con-A）：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组（Con-B）；③错配siRNA体对照组（Con-C）；④不同浓度的siRNA组：10%胎牛血清的RPMI-1640中含不同浓度（6.25、12.5、25.0　nmol/L）的已用脂质体包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行试验。

1.3　OPN基因mRNA水平检测

根据文献[3]，采用荧光实时定量RT-PCR检测OPN基因mRNA水平。

1.3.1　RNA抽提 应用Trizol抽提细胞总RNA。弃尽培养液，加入0.5　mL的Trizol试剂，反复吹打，转移到1.5　mL的eppendorf　管中，加入0.2　mL的氯仿，振荡混匀15　s，室温放置5　min后，　4℃条件下15　000　g离心15　min，吸取上清置另一新的eppendorf　管中，加入0.5　mL　Trizol试剂体积的异丙醇，混匀后室温放置10　min，4℃条件下15　000　g离心10　min，弃上清，沉淀加75%乙醇，7　500　g离心5　min洗涤1次，室温放置10　min左右，加入10　μL的0.1%DEPC水溶解，260　nm测光密度，用40　μg/mLOD计算RNA浓度，用0.1%DEPC水调节浓度至200　ng/μL，备用。

1.3.2　逆转录 取1　μg总RNA，加1　μL　oligo-dT（15　mer），70℃孵育10　min，然后迅速放在冰上冷却2　min，加入以下试剂：5×1　st　strand　buffer　4　μL；0.1　mmol/L　DTT　2　μL；10　mmol/L　dNTP　1　μL；RNase　inhibitor　1　μL；SSRTⅡ　0.5　μL；H2O　0.5　μL。42℃，孵育52　min，然后70℃　15　min。加80　μL水稀释。然后进行实时定量RT-PCR检测。

1.3.3　荧光实时定量RT-PCR 实时PCR具体方法参照ABI公司的标准程序来进行。OPN引物序列为上游：5′-　GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′；下游：5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。FAM探针：5'-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3'-TAMRA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参。50　μL反应体系：OPN基因上、下游引物各1.5　μL，FAM　1　μL，GAPDH探针2.5　μL，2×PCR　Mix　Buffer　26　μL，cDNA　10　μL，H2O　7.5　μL。然后在进行检测，反应条件为，循环反应条件：50℃　2　min，1个循环；95℃　10　min，1个循环；95℃　15　s，60℃　1　min。40个循环。

1.3.4　荧光实时定量PCR结果分析 上述反应完成后，采用Ct法，计算OPN基因相对于GAPDH的Ct（Ct　=Ct　GAPDH－Ct　OPN），以均数±标准差（x±s）表示。

1.4　软琼脂集落形成试验

癌细胞锚着不依赖性增殖采用软琼脂集落形成试验检测，具体试验方法根据文献所述[5]试验进行。

1.5　体外侵袭试验

采用Boyden小室模型方法检测。具体方法参照文献[6]所述方法进行。随机计数10个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

1.6　癌细胞Akt磷酸化检测

转染48　h后，收集siRNA组和对照组癌细胞，以总Akt（Total-Akt）为内参照，采用常规蛋白质印迹检测各组癌细胞总Akt及磷酸化Akt（p-Akt）蛋白水平。

1.7　统计学方法

采用SPSS　11.5软件对数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验。以P

2　结果

2.1　siRNA转染对OPN基因表达的影响

为下调OPN基因表达水平，本研究借助于RNA干扰技术，以siRNA转染大肠癌Colo　205细胞后，以荧光实时定量PCR方法迹检测基因mRNA水平。结果显示，与Con-A组细胞比较，不同浓度siRNA组mRNA明显下调（图1）。

2.2　软琼脂集落形成试验

本研究采用软琼脂集落形成试验观察癌细胞锚着不依赖性增殖情况。结果发现，经siRNA转染的细胞集落生长数明显减少，且呈剂量依赖性（P　＜　0.05）。见图2。

2.3　OPN　siRNA转染对大肠癌细胞侵袭的影响

本研究Boyden小室模型方法了解癌细胞侵袭力变化。结果发现，与Con-A组集穿过滤膜胞数比较，不同浓度siRNA组穿膜的细胞数明显减少（P　＜　0.05）。见图3。

2.4　siRNA转染对大肠癌细胞Akt信号通路的影响

收集转染48　h的细胞，以蛋白质印迹检测Akt磷酸化情况。如图所示，与Con-A组比较，不同浓度siRNA组Akt磷酸化水平下降，且呈浓度依赖性。见图4。

3　讨论

由于RNAi及siRNA具有高效敲除基因表达的作用，已被许多学者用来研究基因功能和基因治疗的重要工具之一。本研究针对OPN基因序列特点，设计合成siRNA，转染处理大肠癌细胞后，采用荧光实时定量PCR检测癌细胞转染效果，结果发现癌细胞OPN　mRNA被抑制。说明siRNA具有明显下调OPNmRNA的效果，可以用于作为探讨在大肠癌侵袭作用中的工具。

锚着依赖性（anchorage　dependence）指的是细胞须黏附于特定的细胞外基质上才能存活的特性和能力。正常真核细胞，除成熟血细胞外脱离基质将会死亡，而绝大多数肿瘤细胞在脱离基质时亦能存活，即可锚着不依赖性生长。检测锚着不依赖性增殖一般参与软琼脂形成集落培养方法。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本课题组发现，经不同浓度的OPN　siRNA转染处理后，癌细胞软琼脂形成集落数明显降低，且呈剂量依赖性。体外侵袭试验发现，经OPN基因siRNA转染处理后的大肠癌细胞侵袭细胞数显著降低，且呈浓度依赖性。由此说明，下调OPN基因表达可明显抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。

癌细胞侵袭转移过程复杂，PI3K/Akt信号通路的激活引起了广大研究学者的注意。Akt作为PI3K下游最重要的信号分子，由于和蛋白激酶A（protein　kinase　A，PKA）和蛋白激酶C（protein　kinase　C，PKC）高度同源，也称为蛋白激酶B（PKB）。它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480多个氨基酸序列构成。目前发现的Akt家族成员有三种亚型：Aktl、Akt2和Akt3，亦称为PKBa、PKBβ、PKBγ，分别由3个不同基因编码[7]。Akt可被许多生长因子如血小板衍生生长因子、表皮生长因子和神经生长因子激活[8]，激活的Akt可以Caspase-9前体蛋白和Bad而使它们失活，从而起到保护细胞作用免于凋亡[9]。许多学者研究发现，Akt信号通路激活，与癌细胞增殖及侵袭能力呈正相关[10-13]。本试验结果显示，OPN基因siRNA转染组Akt磷酸化水平明显下调，且与浓度有关。

本研究提示，抑制大肠癌细胞Akt磷酸化水平，是OPN　基因调控大肠癌细胞增殖、侵袭重要机制之一。

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（收稿日期：2012-09-20 本文编辑：郝明明）