骨碎补化学成分分离鉴定

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1实验材料

1.1仪器：分析型高效液相色谱仪[Agilent1200seriesHPLC（美国Agilent公司），G1379Bdegasser，G1312Apump，G1329AAutosam－pler，G1365D1260MWD]；色谱柱：AgilentzorbaxC18柱（250mm×4.6mm，5μm），制备型高效液相色谱仪为[Agilent1200seriesHPLC（美国Agilent公司），G1361Apreppump，G1365D1260MWD]；制备柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×21.2mm，7μm）；安捷伦6410系列三重四级杆质谱仪（美国Agilent公司）；BRUKERAVANCEⅢ500超导核磁共振波谱仪（TMS为内标，瑞士Bruker公司）。

1.2试剂：柱层析硅胶（青岛海洋化工厂分厂）；SephadexLH-20（美国GE公司）；可剪裁型薄层层析板GF254（天津思利达科技有限公司）；展开剂系统：三氯甲烷-甲醇-水（系列比例，下层）；薄层显色剂：体积分数为10%的硫酸乙醇溶液；分析纯石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇及色谱纯甲醇等有机溶剂（天津市康科德科技有限公司）、分析纯三氯甲烷（天津市江天化工技术有限公司）。

1.3药材：骨碎补药材2012年3月购买于河北省安国市药材市场，经天津中医药大学第二附属医院刘宗昌鉴定为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎，植物标本（20120301）存放于天津中医药大学第二附属医院。

2提取与分离

骨碎补药材20kg用75%乙醇回流提取，减压回收浓缩，用真空干燥箱干燥，得干膏2994g。取其中2400g先用水悬浮，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯（400g）和水层（2000g）萃取物。对乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇，梯度洗脱（100∶00∶100），TLC检识合并相同组分，得5个组分（Fr.1～5）。Fr.1（75g）经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯（100∶00∶100）]分离得到8个组分，其中Fr.1.8（1408mg）经sephadexLH-20和制备高效液相色谱分离得到了化合物6（40mg）和化合物7（38mg）；Fr.2（70g）经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯（100∶00∶100）]分离得到8个组分，其中Fr.2.1（2112mg）经sephadexLH-20和制备高效液相色谱分离得到了化合物2（958mg）；Fr.2.6（9654mg）经sephadexLH-20和制备高效液相色谱分离得到了化合物1（85mg）、化合物3（50mg）以及化合物4（136mg）；Fr.2.8（20630mg）经制备高效液相色谱分离得到了化合物5（73mg）。

3结构鉴定

3.1化合物1：白色无定形粉末，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到准分子离子峰m/z：113.0[M+H]+，推测其分子量为112。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一组芳香氢质子信号：δ7.72（1H，brs，H-5），δ7.20（1H，d，J=3.5Hz，H-3），δ6.58（1H，dd，J=1.5，3.5Hz，H-4）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ113.0（C-3），119.0（C-4），146.6（C-2）和148.0（C-5），13C-NMR谱中还观测到δ161.9推测为羧基碳信号。1H-NMR和13C-NMR谱数据与文献值[4]对照基本一致，确定化合物1为：2-呋喃甲酸。

3.2化合物2：白色油状物，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到特征碎片峰m/z：127.0[M+H]+，推测化合物2分子量为126。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区可以看到一组芳香氢质子信号：δ7.38（1H，d，J=3.5Hz，H-3）、δ6.58（1H，d，J=3.5Hz，H-4），较低场区还可以观测到δ4.62（2H，s，5-CH2OH）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ153.6（C-2）、125.1（C-3）、110.9（C-4）和163.1（C-5），一个连氧碳信号：δ57.5（5-CH2OH），13C-NMR谱中还观测到δ179.5推测为醛基碳信号。经1H、13C-NMR谱数据推测和文献查阅[4]，确定化合物2为5-羟甲基糠醛。

3.3化合物3：白色无定形粉末，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到准分子离子峰m/z：143.0[M+H]+，推测其分子量为142。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一个芳香氢质子信号：δ7.85（1H，s，H-5），在高场区可以观测到一个甲基信号δ2.31（3H，s，2-CH3）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ140.4（C-5）、143.0（C-2）、145.9（C-4）和151.9（C-3），一个甲基信号δ14.6（2-CH3），以及一个羧基碳信号δ170.3（4-COOH）。经1H、13C-NMR谱数据推测和文献查阅[5]，确定化合物3为3-羟基-2-甲基-4-呋喃甲酸。

3.4化合物4：白色无定形粉末。在正离子ESI-MS谱中，可以看到准分子离子峰m/z：127.0[M+H]+，推测其分子量为126。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一组芳香氢质子信号：δ7.93（1H，d，J=5.5Hz，H-5）和δ6.38（1H，d，J=5.5Hz，H-4），高场区还可看到一个甲基质子信号δ2.34（3H，s，2-CH3）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ114.4（C-4）、144.6（C-3）、152.2（C-2）和156.3（C-5），高场区可观测到一个甲基信号δ14.3（2-CH3），13C-NMR谱中还观测到δ175.3（3-COOH）推测为羧基碳信号。经1H、13C-NMR谱数据推测和文献查阅[6]，确定化合物4为2-甲基-3-呋喃甲酸。

3.5化合物5：白色油状物，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到准分子离子峰m/z：111.1[M+H]+，推测其分子量为110。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一组芳香氢质子信号：δ6.65（2H，dd，J=3.5，9Hz，H-3，6）、δ6.75（2H，dd，J=3.5，9Hz，H-4，5）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现3个相应的芳香碳信号：δ116.5（C-4，5）、121.0（C-3，6）和146.4（C-1，2），推测化合物5存在对称结构。经1H、13C-NMR谱数据推测和文献查阅[7]，确定化合物5为邻苯二酚。

3.6化合物6：白色油状物，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到特征碎片峰m/z：155.1[M+H]+和177.1[M+Na]+，推测化合物6分子量为154。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一组芳香氢质子信号：δ6.58（2H，d，J=8.5Hz，H-3，5）、δ6.73（1H，t，J=8.5Hz，H-4），此外还可观测到2个甲氧基信号3.80（6H，s，2，6-OCH3）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ106.6（C-3，5）、109.9（C-4）、136.8（C-1）和149.5（C-2，6），高场区可以看到甲氧基信号δ56.7（2，6-OCH3），推测化合物6存在对称结构。1H-NMR和13C-NMR谱数据与文献值[8]对照基本一致，确定化合物6为2，6-二甲氧基-苯酚。3.7化合物7：白色油状物，易溶于甲醇。在正离子ESI-MS谱中，可以看到特征碎片峰m/z：169.1[M+H]+和191.1[M+Na]+，推测化合物7分子量为168。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）谱低场区，可以看到一个芳香氢质子信号：δ6.42（2H，s，H-3，5），高场区可看到一个甲基信号δ2.25（3H，s），此外还可观测到2个甲氧基信号3.80（6H，s，2，6-OCH3）。在13C-NMR（125MHz，CD3OD）谱上出现4个相应的芳香碳信号：δ107.2（C-3，5）、129.7（C-4）、134.3（C-1）和149.1（C-2，6），高场区可以看到一个甲基信号δ21.5（4-CH3）和甲氧基信号δ56.7（2，6-OCH3）推测化合物7存在对称结构。经1H、13C-NMR谱数据推测和文献查阅[9]，确定化合物7为2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚。

4结论

从骨碎补体积分数为75%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离鉴定了7个化合物，分别为：①2-呋喃甲酸；②5-羟甲基糠醛；③3-羟基-2-甲基-4-呋喃甲酸；④2-甲基-3-呋喃甲酸；⑤邻苯二酚；⑥2，6-二甲氧基-苯酚；⑦2，6-二甲氧基-4-甲基苯酚。化合物1～7均为首次从槲蕨属植物中分离得到。

作者：隋洪飞 单位：天津中医药大学第二附属医院