小鼠胚胎体外培养研究

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【摘要】本文所选用的实验材料为小鼠原核胚，主要研究几种不同溶液、溶液所含不同生长因素、不同培养气象等所对小鼠原核胚发展产生的影响，主要目的是最终找到一种适于小鼠胚胎成长的培养环境以及溶液成分，进而不断优化小鼠胚胎体外培养的体系结构。并且为其它哺乳类动物的胚胎体外培养提供一些参考。

【关键词】小鼠；胚胎；体外培养

0.前言

在迈入新世纪以后，我国的科学技术发展十分迅猛，尤其是我国的生物科技得到了广泛的推广与使用，从而加快了人类社会的发展。胚胎工程是指主要针对胚胎哺乳类动物的胚胎所进行的工程技术操作，之后再将胚胎继续发育，从而使人们获得所需的成体动物的一种全新技术。当前，胚胎工程在蓄牧种繁殖预遗传资源保护、利用方面得到了广泛推广和使用，并且在人类疾病真毒、药物研发等研究方面蕴含巨大应用价值，因此，受到人们高度的关注。

1.材料预方法

1.1实验所需的材料

实验所需的动物：清洁过的雌性预雄性小鼠，所选用的雌性小鼠年龄约在28—35日的日龄范围内，共约250只，而选用的雄性小鼠日龄在56天以上，共有32只。选用的实际预药品主要有，丙酮酸钠、青霉素钠、链霉素、探索氢钠、氯化镁、牛磺酸等。而所选用的仪器主要有倒置显微镜与实体显微镜，离心机、PH仪、显微图像管理系统等。小鼠胚胎培养液主要有三种，即HTF、CZB、KSOM溶液。在配制每一种溶液时都要进行过滤，以便除菌，并且还要放在4摄氏度的环境下进行保存。

1.2小鼠超数排卵

从中选用体重超过25g雌性小鼠，要在小鼠腹腔中注射PMSG20IU，待48小时之后再在腹腔中注射Hcg10IU。雄性小鼠要选用体重超过30g的，严格按照雌性鼠预雄性鼠比例为2：1的比例放在同一个笼中混合养殖，在第二天早晨要检查小鼠的阴道栓，将具有阴道栓的雌性小鼠在20—23小时范围内提取卵母细胞预卵丘细胞的复合体。

1.3采集小鼠的原核胚

在注射hCG后的22小时后，采用颈椎脱臼方法将小鼠处死，在用酒精消毒之后，剪开腹腔，在沿着小鼠卵巢端剪取输卵管，将输卵管放在生理盐水的35mm培养器皿中，然后将培养器皿放进实验室，将小鼠的输卵管放入到洗卵液培养器皿中浸泡一段时间。与此同时，要求实验人员在体视显微镜下准确找到输卵管膨大位置，再使用专门的注射器将其划破，然后轻轻挤压小鼠输卵管端部，从而大量溢出小鼠卵母细胞复合体。

1.4培养小鼠原核胚

首先，要制作一胚胎培养碟，然后将小鼠原核胚放入其中，并且在上部覆盖一层石蜡油，将其放置在碳培养箱中，调节至37度环境下预热四个小时。把细胞复合体取出放在500uLHTF溶液中，利用移液枪吹打几次，并将卵丘细胞原核胚抽取出。多次反复进行此操作，待卵细胞全部脱落后，再将其移动到胚胎培养碟中培养。在移入时标记为0小时，在24小时以后，便开始观察小鼠卵细胞的分裂情况，而在48小时之后便开始观察小鼠细胞分裂情况，在72小时后观察小鼠桑椹胚分裂，在96小时后观察小鼠囊胚分裂轻，而在120小时之后，便开始观察小鼠囊胚孵化情况。

1.5实验设计方案

实验1不同培养基培养小鼠原核胚体，将正常受精之后的小鼠原核胚分为3小组，并且分别放入到三种不同培养基中，即HTF、CZB、KSOM中，共培养约120小时。并且要不断观察小鼠原核胚发育状况，对三组胚胎发育率加以统计，此次实验要进行多次。

实验2置于不同浓度的EGF或者是bFGF的KSOM溶液培养小鼠原核胚体将受精后的正常原核胚分成7组，分别在含有EGF以及bFGF的KOSM溶液中培养120小时。并且要不断观察小鼠的原核胚发育状况，再将各组培养基中小鼠胚胎发育率加以统计。此实验重复进行几次。

实验3利用WOW法培养小鼠原核胚，在受精后的原核胚分成2组，利用WOW法以及成组培养法培养小鼠原核胚胎。在培养约120小时左右，观察其原核胚发育情况，统计各组胚胎发育率，此实验重复进行多次。

实验4将小鼠原核胚体放在不同培养气相中培养，将受精后的原核胚分成3组，分别放在不同的混合气体中培养约120小时。观察小鼠原核胚体发育状况，统计各组胚胎发育率。此实验重复进行多次。

2.结果分析

2.1三组溶液对小鼠原核胚体发育产生的影响

通过实验我们得出：在这三组溶液中，其卵裂率、囊胚率、囊胚细胞并没有较大差异。其中，在KOMS溶液中的卵裂率是最大的，而CZB溶液中囊胚率比其它两种溶液要高，然而，HTF囊胚细胞数是最多的。

2.2 KSOM中EGF或者bFGF含量不同对小鼠原核胚体发育产生的影响

在培养基中，加入不同溶度的EGF或者是BFGF，并不会对小鼠原核胚发育产生较大的影响。

2.3 WOW对小鼠原核胚体发生产生的影响

实验结果表明：从卵裂率方面来分析，WOW要高于对照组，但是，效果不是十分明显；从小鼠受精细胞的囊胚率、囊细胞数角度分析，利用WOW法分裂能力要明显高于对照组。因此，便得出培养小鼠原核胚应该最好利用WOW法，其培养效果较好。

2.4培育气相不同对小鼠原核胚胎发育产生的影响

通过实验证明，在氧气浓度为5%的KSOM培养液与在肺气组CZB溶液中的的培养效果最好。

3.讨论

3.1不同溶液对小鼠原核胚体发育影响

对于哺乳类动物胚体的发育来说，是受很多因素影响的，但是，最主要的影响因素是培养基。然而，当前，哺乳类动物胚体体外发育往往会选用集中溶液包含HTF、CZB、KSOM等。虽然其它类型的胚胎培养液也可以支持哺乳动物胚胎的体外发育。然而，在体外培育胚胎过程中，常表现出一定程度的发育阻滞。在通过大量实验证明，HTF培养效果最好。

3.2不同浓度EGF或者是BFGF对小鼠胚体发育带来的影响

通过实验证明，小鼠的早期胚胎在体外发育过程中，因小鼠胚体原性生长因素在胚体发育中有较强的分泌调控能力，能够快速使胚体发育至囊胚时期。然而，只依靠内源性生长因素，会导致胚胎发育非常缓慢，并且囊胚的发育率偏低，最终导致囊胚细胞较少。因此，胚胎发育需要来自怒踢生殖管道分泌的生长因子的共同参与。但是，如果不具有外源性生长因素，那么会严重阻碍小鼠胚胎发育。

3.3培养方法不同对小鼠胚体发育产生的影响

在体外培养胚胎时，采用微滴方式可以促进胚胎的发育，但是，在选用WOW法培养胚胎时，因胚胎间相互隔离，能够使胚胎分泌的因子不被稀释，通过自分泌的方式作用在胚胎上，与此同时，又可以阻碍有毒物质作用在胚胎上，阻碍其发育率。

3.4培养气相不同对小鼠胚体发育产生的影响

通过上述实验证明，在氧气浓度为5%的条件下，KOSM培养溶液效果要高度其它几组，但是，其它两组培养效果没有较大差异。虽然小鼠胚体能够在高浓度的氧气环境中生长预发育，然而，在低浓度氧气环境下，能够提高胚胎的存活率，更会促进胚胎的发育。

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