重症肌无力大鼠膈肌运动终板的形态学研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇重症肌无力大鼠膈肌运动终板的形态学研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

作者：刘睿　李柱一　张琪　王桂平　刘津平　鞠躬

【关键词】 重症肌无力

Research on morphological changes of end plates in diaphragm of experimental autoimmune myasthenia gravis rats

【Abstract】 AIM： To study the pathological characteristics of the end plate on diaphragm in experimental autoimmune myasthenia gravis animal model by light microscopy and electron microscopy. METHODS: Passively transferred myasthenia gravis animal model was prepared by injection of acetylcholine receptor monoclonal antibody mAb35, and the ultrastructure of the end plates was studied by acetylcholinesterase histochemical technique. RESULTS: Myasthenia symptoms were induced in the experimental group. The end plates of diaphragm showed ultrastructural changes similar to those of myasthenia gravis patients but no change was found in the number of the end plates. No changes were observed in the control group. CONCLUSION: It is suggested that the ultrastructural changes of the end plates on diaphragm may result in the dyspnea in experimental autoimmune myasthenia gravis.

【Keywords】 myasthenia gravis; acetylcholinesterase;receptors,cholinergic;motor endplate; ultrastucture

【摘要】 目的: 探讨重症肌无力大鼠膈肌运动终板的光镜及电镜结构变化.方法: 被动转移乙酰胆碱受体单抗mAb35建立SD大鼠获得性自身免疫性重症肌无力模型，用乙酰胆碱酯酶法显示膈肌运动终板，并行超微结构观察.结果: 实验组大鼠注射mAb35后出现明显肌无力症状，其膈肌运动终板数量基本不变，但出现与重症肌无力患者相似的超微结构变化，对照组则无明显变化.结论: 膈肌出现运动终板超微结构的改变，是重症肌无力被动转移模型大鼠呼吸衰竭的可能原因.

【关键词】 重症肌无力；乙酰胆碱酯酶；受体，胆碱能；运动神经肌肉终板；超微结构

0引言

重症肌无力(MG)是运动终板处最常见的疾病，是一种神经肌肉传递障碍的获得性自身性免疫疾病，临床特征为部分或全身骨骼肌易于疲劳.该病死亡率高，患者最常见的死亡原因为呼吸衰竭,常在几个小时内发展至死亡.膈肌是人体最主要的呼吸肌，我们试图对重症肌无力模型大鼠膈肌运动终板的光镜和电镜结构进行研究，为重症肌无力患者发生呼吸衰竭的机制提供更多的形态学依据.

1材料和方法

11材料SD大鼠10只，雌性，体质量(200±5)g，鼠龄10～12 wk，由本校实验动物中心提供；乙酰胆碱受体单抗mAb35杂交瘤细胞株（ATCC公司）；乙酰胆碱碘化物（FLUKA公司）.

12方法

121重症肌无力被动转移模型的建立参照文献［1］的方法制备乙酰胆碱受体单抗mAb35，将SD大鼠随机分成实验组和对照组各5只，实验组按照文献［2］的方法建立重症肌无力被动转移模型： 各只按025 mg/kg ip含mAb35的Ringers液1 mL(140 mmol/L NaCl , 54 mmol/L KCl, 1 mmol/L CaCl2，24 mmol/L NaHCO3 , pH 74)，对照组各只仅注射Ringers液1 mL.

122症状评估每6 h观察动物毛色、步态 、摄食情况，并测量其呼吸频率及肌力.肌力根据国际标准以它们抓握、悬吊和行走的情况予以分级［3］： 0级，肌力完全正常；1级，3～5次抓握和悬吊实验后肌力减弱；2级，后肢不完全瘫痪；3级，后肢瘫痪不能站立；4级，垂死状态；5级，死亡.

123乙酰胆碱酯酶(AChE)法显示膈肌运动终板42 h后各组大鼠经常规多聚甲醛灌注固定，迅速取下膈肌，制备40 μm厚连续冰冻切片，按照文献［4］的方法行胆碱酯酶染色，切片置于乙酰胆碱酯酶孵育液1 h后蒸馏水洗，以不加底物的孵育液作阴性对照，脱水透明封片.在10倍目镜4倍物镜下每只动物随机选取1个视野统计运动终板数量，以各组5个视野的均值分别代表实验组和对照组运动终板数量，用SPSS软件行t检验作统计学分析.

124透射电镜观察运动终板的超微结构大鼠灌注固定后在含25 g/L戊二醛的后固定液中固定2 h，比照相邻切片上运动终板多的区域取材，按常规电镜脱水、包埋程序制成500 nm超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重电子染色，以JEM2000EX电镜行透射电镜观察.

2结果

21动物模型症状观察实验组SD大鼠在注射后8 h开始出现活动减少，毛皱，精神差，动作笨拙，行动迟缓，行走困难不稳、对刺激反应迟缓，肌张力低，体质量逐渐下降，注射新斯的明可在短时间内改善症状.24 h始症状迅速加重，呼吸频率增快可达140次/min以上.随着肌无力程度的加重，呼吸节律由浅快逐渐发展至深慢呼吸，呼吸困难不断加重，类似重症肌无力患者症状，至36 h有约1/3死于呼吸衰竭，对照组则无明显变化.Fig 1表示实验组大鼠各时间点症状变化情况（分级标准见前材料与方法），可见随着时间推移实验组肌无力症状进行性加重，对照组肌力完全正常为0级故未标出.

图1实验组SD大鼠各时间点症状变化曲线　略

图2胆碱酯酶染色后实验组和对照组膈肌运动终板的光镜与电镜结构

22膈肌运动终板的光镜观察经胆碱酯酶染色后，膈肌上的运动终板清晰可见，镜下为棕褐色椭圆形或扁平小圈，分布在膈肌区域，一条肌纤维上只有一个运动终板.实验组和对照组运动终板数量每视野分别为(994±96)，(1032±127)，经SPSS软件统计分析后P=06470，两组运动终板数量无明显统计学差异（Fig 1）.

23运动终板的电镜观察电镜观察发现实验组膈肌运动终板突触后膜变平坦，突触皱折分级减少短缩，突触间隙增宽，证实了重症肌无力被动转移模型大鼠膈肌运动终板处发生超微结构的病理改变(Fig 2).

3 讨论

重症肌无力是一种典型的获得性自身免疫性疾病，其临床特点是活动后加重、休息后减轻的骨骼肌无力；低频重复电刺激肌电波幅递减；对胆碱酯酶抑制剂治疗有效；免疫学改变是血清乙酰胆碱受体抗体增高；主要病理改变集中在运动终板，表现为突触后膜的皱摺减少变平坦，其上乙酰胆碱受体减少.近年来研究表明部分MG患者有中枢神经系统损害的症状和体征，神经nAChR 与肌nAChR 存在着极高的同源性［5］，已证实AChRAb可与中枢神经系统中的神经nAChR交叉结合［6］，因此MG被认为是一种由AChRAb攻击肌nAChR和神经nAChR的泛化的自身免疫性疾病.

由于不同个体血中AChRAb可能与不同肌nAChR抗原决定簇结合，同一个体不同部位肌组织提取的nAChR与血中AChRAb反应也存在着差异性，此外，不同部位的骨骼肌功能不同, 其运动终板结构不可能完全一致.而对于临床MG患者后期最常出现的呼吸衰竭究竟是呼吸肌运动终板发生了病理变化，还是由于AChRAb与中枢神经系统或周围神经节处的神经nAChR结合造成神经性呼吸抑制，对此尚无研究.为此，本研究采用既能与肌nAChR alpha1亚型结合也能与神经nAChR alpha3、5亚型结合的乙酰胆碱受体单抗mAb35［7］建立重症肌无力被动转移模型，以观察其膈肌的运动终板有无病理改变.

本研究中SD大鼠ip mAb35后成功建立了MG被动转移模型，其临床症状、药理学特点都与MG患者相似，模型大鼠随着症状不断加重出现了呼吸频率和节律的变化，与临床患者发生MG危象时呼吸衰竭相似.同时，本研究两组膈肌的运动终板数量没有明显差异，但实验组膈肌发生了与重症肌无力患者骨骼肌相似的超微结构变化，表现为突触后膜变平坦，突触皱折分级减少短缩，突触间隙增宽，进一步说明了MG模型大鼠的呼吸衰竭与呼吸肌运动终板发生了病理变化有着极为重要的关系，为MG发生呼吸衰竭的原因提供了有力的形态学证据.

此外，本研究中采用乙酰胆碱酯酶染色法定位运动终板，比传统的氯化金浸染法和银染法易于操作，也比用alpha银环蛇毒免疫组化定位简便快捷，能同时用于光镜观察和超微结构研究，也为今后有关运动终板的研究提供了新的方法.

【参考文献】

［1］ 金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术［M］.西安:第四军医大学出版社,2002:15-22.

［2］ Poulas K, Tsouloufis T, Tzartos SJ. Treatment of passively transferred experimental autoimmune myasthenia gravis using papain［J］. Clin Exp Immunol, 2000;120:363-368.

［3］ Christadoss P, Poussin M, Deng C. Short analytical review: Animal models of myasthenia gravis［J］. Clin Immunol, 2000; 94(2):75-87.

［4］ 张琪，顾晓明.神经端侧缝合术后肌肉的组织学变化［J］.实用口腔医学杂志，1999;15(5):332-334.Zhang Q, Gu XM. Histological observation of target muscle after endtoside neurorrhaphy［J］.J Pract Stomatol,1999;15(5)：332-334.

［5］ 李柱一，游国雄，鞠躬，等.中枢神经烟碱型乙酰胆碱受体研究进展［J］.第四军医大学学报,1996;17(增刊):1-7.Li ZY, You GX, Ju G, et al. The research evolvement on central nervous nicotinic acetylcholine receptor［J］. J Fourth Mil Med Univ,1996;17(Suppl):1-7.

［6］ 李柱一，邱晓飞.重症肌无力乙酰胆碱受体抗体与猴神经烟碱型乙酰胆碱受体之间的免疫结合反应［J］.第四军医大学学报,2001;22（16）:1466-1468.Li ZY, Qiu XF. The Immunoreaction between AChRAb and neuronal nicotinic AChR on monkey［J］. J Fourth Mil Med Univ,2001;22(16) :1466-1468.

［7］ Tzartos SJ, Rand DE, Einarson BL,et al. Mapping of surface structures of electrophorus acetylcholine receptor using monoclonal antibodies［J］. J Biol Chem,1981;256:8635-8645.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30270485）

1 第四军医大学唐都医院神经内科，陕西 西安 710038，

2 北京武警总队医院口腔科，北京 100039，

3 第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033