桑根白皮素调控人结肠癌HCT116细胞周期阻滞及其抑制细胞增殖的体外研究

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摘要：目的 观察中药提取物桑根白皮素对结肠癌HCT116细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响，探讨其相关机制。方法 体外以不同浓度桑根白皮素作用于HCT116细胞72 h，CCK-8法检测细胞增殖，计算细胞生长抑制率和IC50，取25.4 μmol/L和50.8 μmol/L桑根白皮素作用于HCT116细胞24、48、72 h，CCK-8法检测细胞增殖，镜下观测细胞形态并摄图；25.4 μmol/L桑根白皮素作用于细胞24 h后，流式细胞仪检测细胞周期分布，荧光显微镜下TUNEL法原位检测细胞凋亡；Western blot检测药物干预后β-catenin通路蛋白和细胞周期蛋白的表达变化。结果 桑根白皮素对HCT116细胞增殖的抑制作用呈浓度/时间依赖性，72 h IC50为25.4 μmol/L；桑根白皮素阻滞HCT116细胞周期于G0/G1期和G2/M期，对细胞凋亡无明显诱导作用；桑根白皮素显著降低β-catenin通路相关蛋白β-catenin、c-Myc及细胞周期调控蛋白cyclinD1、cyclinB1的表达。结论 桑根白皮素可阻滞HCT116细胞周期，抑制细胞增殖，其机制可能是通过下调β-catenin通路活性，并抑制细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinB1表达实现的。

关键词：桑根白皮素；结肠癌；细胞周期；细胞增殖；β-catenin通路

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0072-04

Abstract：Objective To investigate the effects of Morusin on cell line proliferation， cell cycle and cell apoptosis of colorectal cancer hct116 cell；To discuss its mechanism. Methods HCT116 cells were treated with different concentrations of Morusin for 72 h. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay， and cell growth inhibition rate and IC50 value were calculated. HCT116 cells were treated with 25.4， 50.8 μmol/L Morusin for 24 h， 48 h and 72 h. Cell morphology was observed under the microscope， and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. After HCT116 cell line was treated with 25.4 μmol/L Morusin for 24 h， cell cycle phase distribution was detected by flow cytometry and the cell apoptosis was detected by TUNEL assay under the fluorescence microscope. Post-intervention protein expressions were detected by Western Blot. Results The inhibitory effects of Morusin on the proliferation of HCT116 cell line was concentration/time dependent and IC50 value at 72 h was 25.4 μmol/L；Morusin induced the cell cycle arrest at G0/G1 phase and G2/M phase， but there was no induction of cell apoptosis；Morusin significantly decreased the expression of β-catenin and its target c-Myc， and downregulated the expressions of cyclinD1 and cyclinB1， which were involved in cell cycle regulation. Conclusion Morusin can inhibit HCT116 cell cycle and the proliferation of colorectal cancer cells. Its mechanism might be realized by suppressing the activity of β-catenin pathway and reducing the protein expressions of cyclinD1 and cyclinB1.

Key words：Morusin；colorectal cancer；cell cycle；cell proliferation；β-catenin pathway

结肠癌为常见的消化系统恶性肿瘤，临床现行治疗方法的有效率仅为50%左右，肿瘤细胞对化疗药物的耐药是治疗失败的主因。桑根白皮素是从中药桑白皮中分离出来的单体，被证实有抗肿瘤作用[1-2]。虽有研究表明，其能够通过诱导细胞凋亡而抑制结肠癌HT-29细胞生长[3]，但关于桑根白皮素抗结肠癌及相关机制的研究依旧甚少。本实验用桑根白皮素体外干预人结肠癌HCT116细胞，观察其对HCT116细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及细胞培养

HCT116人结肠癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。培养条件为37 ℃、5%CO2；培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的McCoy's 5A培养基；用含0.01%EDTA的0.25%胰酶进行消化传代，待细胞处于对数生长期后，用于实验。

1.2 药物

桑根白皮素对照品（纯度99%），购自上海中医药标准化研究中心，溶于二甲基亚砜（DMSO）中制备保存液，浓度为4800 μmol/L，储存于-20 ℃备用。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清（奥地利PAA Laboratories GmbH公司）；CCK-8试剂（日本Dojindo公司）；兔抗人β-catenin一抗、兔抗人GSK-3β一抗、兔抗人c-Myc一抗（美国CST公司）；McCoy’s 5A培养基（GIBCO公司）；鼠抗人β-actin一抗、HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG二抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗（美国Proteintech公司）；鼠抗人cyclinD1一抗、兔抗人cyclinB1一抗（美国Signalway Antibody公司）；RIPA裂解液、BCA试剂盒（碧云天公司）；ECL发光试剂盒、CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物公司）；Steril Gard超净工作台（美国Baker公司）；Model 550酶标仪、Model Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 细胞分组及干预

细胞分为空白组（不接种细胞）、对照组（接种细胞不加药物）、实验组（桑根白皮素10、20、30、40、50 μmol/L或者12.7、25.4、50.8 μmol/L），每组设6个复孔，作用24、48、72 h。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 CCK-8法检测细胞增殖 96孔培养板中接种细胞悬液（100 μL/孔，浓度为5×104/mL），细胞分组、给药，37 ℃、5%CO2条件下培养；药物作用结束后，每孔吸尽培养液，更换100 μL新鲜培养基，并加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育3 h，在酶标仪450 nm处测吸光度（OD值），计算抑制率。抑制率（%）=1-[（实验孔OD值-空白孔OD值）÷（对照孔OD值-空白孔OD值）]×100%。

1.5.2 流式细胞仪检测细胞周期 25.4 μmol/L桑根白皮素作用于HCT116细胞24 h后，消化细胞并和培养液一起制备细胞悬液，1200 r/min离心5 min，弃上清；PBS洗涤2次，离心后弃PBS，沉淀细胞内加入300 μL PBS，温柔吹打，移液于流式管内，流式管内加700 μL、4 ℃预冷的无水乙醇，4 ℃固定过夜；细胞1500 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2次，1500 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞于500 μL含100 U/mL RNaseA的PBS中37 ℃温浴30 min；加碘化丙啶（PI）至终浓度为50 μg/mL，室温孵育30 min，用200目尼龙网过滤后，上流式细胞仪作DNA细胞周期分布检测。以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标作图。

1.5.3 TUNEL法检测FITC标记的凋亡细胞 培养板中接种细胞悬液（100 μL/孔，1×105/mL），含终浓度为25.4 μmol/L桑根白皮素的培养液作用24 h后，吸除培养液，PBS洗3次。按产品说明，4%多聚甲醛室温固定30 min，1%Triton X-100通透液室温促渗5 min，PBS洗3次；每孔加含1000 U脱氧核糖核酸酶I（RNase Ⅰ）反应液室温处理30 min，PBS洗3次；配制含生物素标志的dUTP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶的工作液，每孔加50 μL，37 ℃避光反应60 min，PBS洗3次；每孔加Streptavidin-FITC标记工作液，37 ℃避光反应30 min，PBS洗3次；Hoechst核染液室温避光复染细胞核15 min，PBS洗3次。封片后荧光显微镜观测，激发波长450～500 nm，每个样品取5个视野，摄图；Image J软件计数阳性细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数÷细胞总数×100%。

1.5.4 Western blot检测蛋白表达 12.7、25.4、50.8 μmol/L桑根白皮素作用于HCT116细胞24 h后，吸除培养液，裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，等量的蛋白样品（40 μg）经10%SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，β-actin按1∶5000稀释，GSK-3β、β-catenin、c-Myc、cyclinD1、cyclinB1一抗按1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次后，加入1∶2000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST再次洗涤3次，加入ECL发光底物，在WB凝胶成像系统中成像、摄图。应用GraphPad Prism 5.0软件对细胞吸光度值和细胞生长抑制率作回归分析，计算IC50。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，Levene法检验方差齐性，方差齐单因素多水平多个均数比较采用Dunnett-t检验，方差不齐采用多样本非参数Kruskal-Wsllis H检验，各药物浓度组在不同时点的细胞吸光度值采取重复测量的两因素多水平方差分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 桑根白皮素对HCT116细胞增殖的影响

各浓度桑根白皮素作用72 h，检测细胞OD值，20、30、40、50 μmol/L药物浓度组OD值与对照组比较，差异有统计学意义（P

2.2 桑根白皮素对HCT116细胞形态的影响

HCT116细胞经低浓度（25.4 μmol/L）、高浓度（50.8 μmol/L）的桑根白皮素作用72 h后，表现出不同程度细胞体积缩小、细胞皱缩、边缘毛糙、伪足消失，高浓度组作用最显著，见图1。

2.3 桑根白皮素对HCT116细胞周期和凋亡的影响

25.4 μmol/L桑根白皮素作用HCT116细胞24 h，与对照组比较，G0/G1期和G2/M期细胞比例显著增高，S期细胞比例显著降低（P

2.4 桑根白皮素对β-catenin通路蛋白和细胞周期蛋白表达的影响

12.7、25.4、50.8 μmol/L桑根白皮素作用于HCT116细胞24 h后，糖原合成酶3β（GSK-3β）表达增高，通路核心蛋白β-catenin和下游靶基因c-Myc蛋白表达均明显降低，下调作用呈浓度依赖性；细胞周期调控相关的细胞周期蛋白cyclinD1和cyclinB1蛋白表达亦有下调，50.8 μmol/L组下调最明显，见图3。

3 讨论

本研究中，我们观察到桑根白皮素在体外抑制HCT116细胞增殖，并且作用呈浓度/时间依赖。我们同时检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响，结果显示，桑根白皮素显著降低S期细胞比例、提高G0/G1期和G2/M期细胞比例，提示桑根白皮素阻滞细胞周期在G0/G1期和G2/M期；而对细胞凋亡却无明显诱导作用，这与此前的报道并不一致[3]。

细胞周期蛋白（cyclins）参与调控细胞周期进程。其中cyclinD1促进细胞由G1期进入S期，能够促进细胞增殖；cyclinB1则促进细胞由G2期进入M期，基因敲除cyclinB1使其完全失表达后，细胞即阻滞在G2期，二者的下调均能阻滞细胞周期。本实验结果显示，桑根白皮素作用后，cyclinD1和cyclinB1的表达均下调，高浓度组尤为显著，这与细胞周期阻滞在G0/G1期和G2/M期的结果是相符的。

cyclinD1是Wnt/β-catenin通路下游靶基因，经典Wnt/β-catenin通路是结肠癌发生发展中的重要通路，几乎所有结肠癌中都存在经典β-catenin通路的异常激活[4]，激活的β-catenin通路不仅促进结肠癌的形成，还对维持肿瘤生长起到重要作用[5-6]。此通路的核心蛋白为β-catenin，正常状态下，GSK-3β参与组成的降解复合物使β-catenin磷酸化被降解，维持β-catenin在细胞质中的低浓度稳态；当Wnt/β-catenin通路中的任一环节发生突变时，β-catenin不能被降解，在胞质中累积并移至细胞核内，启动下游靶基因的表达，这就是Wnt/β-catenin通路的激活。GSK-3β活性如受抑制则β-catenin表达增高，通路下游相关靶基因转录亦增强；GSK-3β表达增高则β-cateni表达降低，下游靶基因转录减弱[7]。研究结果显示，桑根白皮素能上调GSK-3β表达，从而下调β-catenin表达，其对二者的调控作用均呈浓度依赖性，且量效趋势是一致的。β-catenin通路激活后，激动下游靶基因转录，除上文提到的cyclinD1外，c-Myc也是重要靶基因之一，是公认的促细胞增殖因子[8]，研究中，我们同样观察到桑根白皮素对c-Myc的抑制作用呈浓度依赖性，这可能也是其抑制HCT116细胞增殖的机制之一。

综上所述，桑根白皮素通过阻滞细胞周期在G0/G1期和G2/M期，从而抑制人结肠癌HCT116细胞增殖，其机制可能与下调β-catenin信号，抑制其靶基因c-Myc转录，并抑制细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinB1表达相关。

参考文献：

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[2] Ma JP， Qiao X， Pan S， et al. New isoprenylated flavonoids and cytotoxic constituents from Artocarpus tonkinensis[J]. J Asian Nat Prod Res，2012，12（7）：586-592.

[3] Lee JC， Won SJ， Chao CL， et al. Morusin induces apoptosis and suppresses NF-κB activity in human colorectal cancer HT-29 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，372（1）：236-242.

[4] Prasetyanti PR， Zimberlin CD， Bots M， et al. Regulation of stem cell self-renewal and differentiation by Wnt and Notch are conserved throughout the adenoma-carcinoma sequence in the colon[J]. Mol Cancer，2013，12（1）：126-132.

[5] Shenoy AK， Fisher RC， Butterworth EA， et al. Transition from colitis to cancer：high Wnt activity sustains the tumor-initiating potential of colon cancer stem cell precursors[J]. Cancer Res，2012，72（19）：5091-5100.

[6] Kanwar SS， Yu Y， Nautiyal J， et al. The Wnt/β-catenin pathway regulates growth and maintenance of colonospheres[J]. Mol Cancer，2010，9（8）：212-223.

[7] Song S， Mazurek N， Liu C， et al. Galecetin-3 mediates nuclear beta-catenin accumulation and Wnt signaling in human colon cancer cells by regulation of glycogen synthase kinase-3beta activity[J]. Cancer Res，2009，69（4）：1343-1349.

[8] Dang CV. MYC on the path to cancer[J]. Cell，2012，149（1）：22-35.

（收稿日期：2015-01-03；编辑：华强）