长期偏施氮肥对桑树根际土壤微生物碳源利用能力的影响
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摘要：采用Biolog微生态技术，研究长期（4年-4Y，17年-17Y，32年-32Y）偏施氮肥桑树根际土壤微生物碳源利用能力变化。结果表明，不同施肥年限及不同取样时期桑树根际土壤微生物利用单一碳源能力不同，4Y土壤微生物活性（AWCD）、Shannon多样性指数及对糖类、氨基酸类、胺类碳源的利用能力均高于其他处理土壤，且与32Y土壤均达显著差异水平（P
关键词：桑树；根际微生物；碳源利用能力
中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6108-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.025
Abstract： Changes in soil microbial carbon source utilization ability of mulberry rhizosphere in long-term partial application of nitrogen fertilizer were investigated by using Biolog micro ecological technology. The results showed that the carbon utilization ability in different fertilization years and sampling date was different. The AWCD， Shannon diversity index and the utilization ability of carbohydrates， amino acids， amines in 4Y soils were higher than in other treatment soils， and had significant difference compared with 32Y soils（P
Key words： mulberry； rhizospheric microorganism； carbon source utilization ability
据研究，微生物在养分转运和土壤肥料维持方面具有重要作用[1，2]；施用氮肥影响土壤微生物种群结构和碳代谢功能多样性，但施用一定量的氮肥对土壤微生物种群结构或多样性无影响[3-8]；氮肥施用对土壤微生物种群结构和碳代谢功能多样性的影响比较复杂，可能与植物类型、氮肥用量、氮肥施用年限以及生物和非生物因素等有关[9-11]。
湖北省是中国中部地区重要的蚕桑生产基地，桑园大多分布在山坡地带，桑园立地条件普遍较差，桑树产叶量较低，为获得桑叶高产，蚕农长期偏施氮肥（氮肥用量高达450 kg/hm2），降雨过后桑园土壤板结，土壤酸化现象严重[12]。过量施用氮肥不仅导致土壤对氮素的调控功能下降，还会污染漳河、沮河等长江重要支流，对三峡库区、丹江口库区造成面源污染，影响丹江口水库的水质。目前对长期过量施用氮肥对桑园土壤微生物多样性的影响[13，14]的研究很少。本研究目的是明确长期过量施用氮肥对桑园土壤微生物利用碳源的影响，为桑园科学施肥管理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验处理
试验在湖北省农科院经济作物研究所桑树资源圃进行，以资源圃1982、1997和2010年栽植的育71-1（Morus alba L.）为试验材料，株行距为1.0 m×1.5 m，栽植后，根据当地蚕农的生产习惯，每年施450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2过磷酸钙、180 kg/hm2硫酸钾镁，春季沟施40%，夏伐后沟施60%。
1.2 土壤样品采集
2014年和2015年，在大蚕用叶期（5月）、夏伐后新梢旺长期（7月）、新梢缓慢生长期（9月）、新梢停长期（11月），采集施肥年限分别为4年（4Y）、17年（17Y）、32年（32Y）的土壤样品，铲去表土，深挖5～20 cm，将土壤连同桑涓系一起装入无菌袋、编号。土样带回实验室后，将同一处理的样品混合，采用抖根法[15]取根际土壤与非根际土壤，并分成2份，一份土样（约200 g）于4 ℃保存，供微生物分析，另一份土样自然风干，供土壤理化性质分析[16]。土壤样品的基本理化性质见表1。
1.3 桑园土壤微生物功能多样性测定与计算方法
利用Biolog（Biolog Eco PlateTM）技术，采用Garland等[17]的方法并稍加变动，研究土壤微生物碳代谢多样性。在5 g土壤样品中加入45 mL灭菌8.5 g/L NaCl溶液，在摇床上振荡15 min，静置片刻，然后将土壤样品稀释（稀释度10-3），用排枪吸取稀释液至96孔Biolog Eco板中，150 μL/孔，将接种好的板置于28 ℃恒温培养箱中培养，每隔24 h在590 nm处读取数据。培养时间共168 h。
微平板中溶液吸光值平均慰籽丈变化率（AWCD）用于描述土壤微生物代谢活性。计算方法如下：AWC（Ci-Ri）/n，式中Ci为每个有培养基孔的光密度值，Ri为对照孔的光密度值，n为培养基孔数，Biolog Eco板n值为31。参照郭正刚等[18]的方法，用Shannom-Wiener多样性指数（H）描述土壤微生物多样性丰度，用96 h的平均单孔颜色变化率AWCD值计算H。多样性指数H=-ΣPilnPi，式中，Pi为第i孔的相对光密度值与整个微平板的相对光密度值总和的比值，Pi=（Ci-Ri）/Σ（Ci-Ri）。
1.4 数据统计分析
土壤理化测试数据和微生物多样性指数的显著性分析采用单因素方差分析，选取120 h的平均颜色变化率AWCD对微生物碳源利用进行分析，方差分析和主成分分析采用SPSS19.0软件。
2 结果与分析
2.1 桑树根际土壤微生物AWCD变化
平均单孔颜色变化率（AWCD）反映了土壤微生物群落对单一碳源整体利用情况，代表土壤微生物活性。从图1可以看出，在168 h的培养期间，各处理土壤AWCD从24 h开始迅速提高，144 h左右达到稳定状态，因此，本研究选择光密度增加时期即120 h的光密度用于统计分析。不同施肥年限及不同取样时期桑树根际土壤微生物利用单一碳源能力不同，4Y和17Y土壤微生物利用单一碳源的能力AWCD高于32Y土壤；不同取样期间比较，11月份取样4Y和17Y土壤AWCD显著高于其他取样日期。逐步回归分析表明，土壤有机质含量与AWCD显著相关（表2）。
2.2 桑树根际土壤微生物群落对Biolog Eco板6类碳源的利用
微生物对不同碳源的利用可以反映微生物的代谢功能类群。总体而言，4Y土壤微生物对不同碳源的利用能力较强，而32Y土壤微生物碳源利用能力较弱（图2）。4Y土壤微生物对糖类、氨基酸类及胺类碳源的利用高于其他年限土壤，且与32Y土壤在4次取样时期均达差异显著水平（P
2.3 桑树根际土壤微生物对碳源利用的主成分分析
碳源利用能力主成分分析见图4。不同施肥年限土壤及不同取样日期之间有较大的分离，表明土壤微生物代谢特征表现出较大差异。第1主成分和第2主成分分别解释土壤微生物代谢31种基质的62.46%和15.21%（2014年）及66.45%和14.50%（2015年）的变异。4Y土壤和17Y土壤间离散距离较小，而与32Y土壤间的离散距离较大，表明不同施肥年限显著影响土壤微生物碳代谢功能群结构。
3 小结与讨论
前人研究表明，不合理的肥料种类及数量可能导致土壤环境的恶化，并破坏土壤微生态系统的平衡[19，20]。本研究结果表明，与4Y和17Y相比，32Y土壤微生物碳源利用能力显著降低（图1、图2）；土壤微生物对氮肥的反应取决于许多因素，包括肥料类型、肥料数量、应用时间、土壤特性及作物类型等，对于桑树，长期施用氮肥每年施450 kg/hm2，确实减少了土壤微生物碳源利用能力及多样性。
前人对茶、番茄、棉花、烟草等的研究表明，土壤微生物的活性和功能多样性随栽植时间的增加而减少[21-23]。Fu等[23]报道，芦笋土壤微生物种群结构随栽培时间的延长而减少。本研究中17Y和32Y土壤微生物多样性的减少不仅取决于栽培时间，而且与施肥管理关系更密切。因此，不同植物类型对栽培时间及不同肥料的反应需要进一步深入研究。
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