胶原-PVA水凝胶溶胀性能

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前 言

聚乙烯醇( PVA) 是一种无毒性、具有生物可降解性和良好生物相容性的高分子材料［1］，力学性能优良、化学性质稳定、易于成型，可作为医药、化妆品行业中的功能材料。但其表面缺乏细胞识别位点，细胞相容性较差，不能单独作为组织工程支架应用［2］。胶原具有优良的生物相容性和低抗原性，可以介导细胞间的传导和相互作用，其纤维状结构非常有利于组织培养中的细胞黏附、增殖和分化等功能，在生物医学领域有着广泛的应用价值。胶原支持很多不同组织的生长，但单纯胶原凝胶力学强度较差，耐热性不好［3］等，限制了其在组织工程领域［4］的应用，需对其改性来弥补其不足［5 －6］。因此，以聚乙烯醇和胶原为原料制备复合型材料，成为一种简单有效的解决途径。聚乙烯醇 － 胶原水凝胶( pva － Collagen Hydrogel，PCH) 由于毒性低、生物相容性好等特点，在生物、医学、微生物、渔业、食品等领域已有广泛的应用，因而最早引起人们的关注［7］。所以将聚乙烯醇与胶原以不同配比制备胶原 － 聚乙烯醇水凝胶，可提高两者的应用性能。使得胶原/PVA 复合水凝胶既具有天然蛋白质的可生物降解性、生物相容性等，又具有较好的吸湿性能［8 －9］和力学性能。在胶原 － 聚乙烯醇( PVA) 水凝胶研究领域中，一些研究人员利用化学交联法制备水凝胶，比如溶液共聚、阴阳离子共聚法［7，10 －18］，其缺点在于交联条件过于激烈，大部分游离基团均以共价键的形式被交联而失去反应活性。本试验将 PVA 改性后，温和条件下使其与胶原共价交联，同时辅以物理交联制备复合水凝胶。本论文主要通过不同原料配比的水凝胶在不同介质中的溶胀率变化情况，研究水凝胶的溶胀特性、影响因素及影响程度，并且通过数学方程拟合对其平衡溶胀比进行计算。同时，探讨了电解质和 pH对所制备 PCH 溶胀特性的影响程度，旨在更好地掌握水凝胶的溶胀规律，为其在体表创伤修复中的应用奠定基础。

1 试验部分

1． 1 试剂及仪器

PVA( 聚合度: 1700 ± 50，醇解度99% ，成都科龙化工公司) ;胶原( 猪皮为原料自制［19 －20］，冻干保存; 经丙烯酰胺凝胶电泳( SDS －PAGE) 检测，在 116kDa 附近有 2 条相邻带，在 200kDa 附近有一条带) ;1 － ( 3 － 二甲氨基丙基) － 3 － 乙基碳二亚胺盐盐酸( EDC•HCl) 和 N－ 羟基琥珀酰亚胺( NHS) ( 纯度均 ＞99% ，上海延长生化试剂有限公司) ;其它试剂均为市售分析纯试剂，使用前未经纯化处理。恒温水浴锅( KXS 型，成都科析仪器成套公司) ;电子天平( FA2004N 型，上海箐海仪器有限公司) 。

1． 2 试验步骤

1． 2． 1 胶原 － 聚乙烯醇水凝胶的制备

1． 2． 1． 1 PVA 的改性

将 PVA 于 60℃ 条件下溶于二甲亚砜( DMSO) ，待完全溶解后加入少量三乙胺( TEA) ，水浴升温至 75℃。然后将丁二酸酐的 DMSO 溶液逐滴加入，反应持续 4． 5h 后，将溶液降至室温。将反应液再缓慢倒入快速搅拌的20% 氢氧化钠甲醇溶液，使改性的PVA 充分凝聚沉淀。然后依次用蒸馏水、0． 2mol/L 的盐酸溶液、蒸馏水洗涤，最终洗涤液的 pH 值为 5 ～ 6。产物经真空干燥后密封保存，标记为 sP-VA。采用酸碱滴定法测定 sPVA 中的羧基含量为( 0． 119 ±0．012) mmol/g。

1． 2． 1． 2 胶原溶液的配制

取自制胶原，准确称重后溶于 0．1mol / L 醋酸溶液，4℃ 条件下搅拌溶解后配成浓度为 0． 5% 的胶原溶液，保存备用。

1． 2． 1． 3 胶原 － PVA 水凝胶的制备

利用 EDC 和 NHS 交联 sPVA 与胶原。sPVA 与胶原的绝干质量比及对应的编号如表 1 所示，EDC 和 NHS的剂量均为 0． 03mmol/g 溶液。对于一定质量的 sPVA 溶液，胶原溶液与EDC 和 NHS 的用量是一定的。NHS先被加入 sPVA 溶液，待 NHS 完全溶解后，再加入 EDC。搅拌 60min 后，加入胶原溶液，在 25℃ 下搅拌 4 ～ 5h。随后，将反应液缓慢倒入培养皿( 直径9cm) ，立即在 － 20℃ 下冷冻; 冷冻 10～ 12h 后，然后再解冻 4 ～ 5h。以上冷冻 － 融解步骤视为一个冻融周期。经过 5 个冻融周期后，将制备的水凝胶放入蒸馏水中浸泡 3d( 常换水) ，除去残余的交联剂。最后将水凝胶冻干后干燥密封保存。

1． 2． 2 胶原 － 聚乙烯醇水凝胶的溶胀研究

1． 2． 2． 1 胶原 － 聚乙烯醇水凝胶在蒸馏水与生理盐水中的溶胀情况

称取一定质量不同配比的 PCH分别浸泡在蒸馏水和生理盐水中，置于 25℃水浴中，每隔 20 ～ 30min 取出水凝胶后用湿润的滤纸拭去其表面水分，称量其溶胀后质量，反复多次至溶胀时间为 5 ～ 6h; 将水凝胶浸泡过夜，次日再间隔一定时间取出称重，总时间为 24h 左右。对试验结果进行分析，讨论水凝胶在水中的溶胀情况以及电解质对其溶胀的影响。

1． 2． 2． 2 溶液 pH 对水凝胶溶胀的影响

称取一定质量不同配比的胶原 －聚乙烯醇水凝胶分别放入不同 pH 值的溶液( 电解质浓度均为 0． 1mol/L)中，置于 25℃ 的水浴中，称量方法同上所述。分析试验结果，研究 PCH 在不同 pH 条件下的溶胀情况。

1． 2． 2． 3 胶原 － 聚乙烯醇水凝胶在不同 pH 下的溶胀情况

称取一定质量不同配比的凝胶分别放入 NaAc － HCl 缓冲液( pH =1． 9)中，置于 25℃的水浴中，每隔 20min 取出水凝胶用湿润的滤纸拭去其表面水分后进行称量，然后重新放入溶液中，如此反复 3 次后将水凝胶放入 Tris －HCl 缓冲液 ( pH = 8． 4 ) 中，同样每隔20min 进行测量并重复 3 次。将一次pH = 1． 9、一次 pH = 8． 4 条件的溶胀过程称为一轮，共进行 3 轮酸性 － 碱替条件的溶胀，对结果进行分析讨论。以上缓冲液的电解质浓度均为0． 1mol / L。上述各个条件下不同水凝胶的溶胀情况，均根据不同时间点溶胀前后的质量情况计算溶胀比，溶胀比( Q)的计算按照式( 1) 进行:

2 结果与讨论

2． 1 胶原 － 聚乙烯醇水凝胶在蒸馏水与生理盐水中的溶胀情况

不同编号的水凝胶材料在蒸馏水和生理盐水中的溶胀比情况如图 1 和图 2 所示。根据对各组水凝胶溶胀的变化规律，认为采用数学方程对水凝胶的溶胀情况进行拟合，可以更好地了解水凝胶的溶胀特性，图 1、图 2 中的曲线即为各组水凝胶的方程拟合曲线。拟合所采用的数学方程是二元指数相关方程( Two － phase ExponentialAssociation Equation) ，方程形式如式( 2) 所示。因方程的变化趋势和水凝胶的溶胀过程相似，所以采用此方程进行拟合，以求得水凝胶的平衡溶胀比，更加科学准确。PCH 在蒸馏水以及生理盐水中溶胀比的拟合方程参数，以及根据拟合结果计算出各水凝胶的平衡溶胀比如表 2 所示。由图 1 与表 2 可以看出: 不同配比的水凝胶在蒸馏水中的平衡溶胀比不一样，平衡溶胀比大小: 1 号 ＜ 2 号＜ 3 号 ＜ 4 号 ＜ 5 号。其平衡溶胀速率都很大，但仍有细微的差别，平衡溶胀速率也呈现: 1 号 ＜ 2 号 ＜ 3 号 ＜ 4号 ＜ 5 号。一般认为，高分子凝胶材料的溶胀通常包括 3 个连续的过程。首先，水分子扩散进入到凝胶内部; 随后，凝胶中高分子链发生松弛; 最后，整个高分子链在水中伸展，凝胶网络达到 溶 胀 平 衡［16］。在 影 响 聚 乙 烯醇—胶原水凝胶的平衡溶胀比的因素中，理论上讲，水凝胶的平衡溶胀比会随着聚乙烯醇含量的增加而增加，因为 PVA 的亲水基团显然比胶原的多，因为 PVA 的每一个结构单元都具有亲水性基团羟基，但试验结果表明: 水凝胶的平衡溶胀比随着胶原的含量增加而增加。产生此现象的原因可能是胶原 － 聚乙烯醇水凝胶材料中形成的，是以 PVA 碳 － 碳刚性骨架为主的网络结构，随着胶原柔性链段含量的增加，在溶液中伸展的越开，空隙越多，可以与水结合的部位和空间也随之增多，因此平衡溶胀比有增大的趋势。至于不同配比凝胶的溶胀速率相差不大，可以这样理解: 由于反复冻融使得 PVA 分子链与胶原分子链之间产生物理交联，所以凝胶溶胀时 PVA分子链的伸展与胶原分子链的伸展相互牵制，这种牵制作用的结果，使 PVA分子链伸展的快慢程度与胶原分子链伸展的快慢程度趋于一致，从而体现出凝胶的溶胀速率很少受其组成影响的特性［17］。由图 1、图 2 和表 2 可以看出: 不同配比的水凝胶在 0． 9% 的生理盐水中的平衡溶胀比及其平衡溶胀速率的溶胀规律，与水凝胶在蒸馏水中的溶胀规律类似。可以发现: 2 号与 3 号水凝胶在盐水中的平衡溶胀比

相对于蒸馏水中的平衡溶胀比有所减小，且减小幅度较大，3 号减小幅度最大; 1 号、4 号、5 号在盐水中的平衡溶胀比相对于蒸馏水中的平衡溶胀比有所增加，但增幅很小，增幅1 号 ＞ 5 号 ＞ 4 号，可能是因为生理盐水的电解质浓度很低，所以影响不明显而已。因此，我们得到初步结论: 电解质对平衡溶胀比与平衡溶胀速率的影响较弱，电解质可降低水凝胶的平衡溶胀比。胶原 － PVA 水凝胶在较低离子强度下，具有较高的平衡溶胀比。由于存在 Donnan 效应，溶液中的无机离子通过溶胀进入到水凝胶内，一方面使凝胶内外的渗透压降低，另一方面大量的自由离子迁移进入凝胶内部，对聚电解质分子网络产生静电屏蔽作用，使得分子链间的静电斥力作用减弱，阻碍了水合作用，这 2 种作用都会使水凝胶的平衡溶胀比下降［18］。还可能是因为聚乙烯醇之间的氢键缔合结构因电解质的存在而使数目有所增加，故溶胀比减小［21］。NaCl 的加入，使溶液的极性增强，从而使疏水效应增强; 由于NaCl 的存在，大分子链周围单位体积中水分子的数目相对降低，使亲水作用下降［22］。4 号、5 号水凝胶平衡溶胀比小幅度的增加，可能是因为生理盐水的电解质浓度很低，所以影响不明显，又因其含有胶原，可能存在类似低电解质溶液促进蛋白质溶解的作用。采用数学方程对水凝胶溶胀过程的拟合结果较为理想。水凝胶在蒸馏水和溶液中的溶胀规律相似，均表现出前期快速溶胀，后期缓慢达到溶胀平衡的规律。通过拟合，不仅可以从图中明显地看出水凝胶的整个溶胀过程，发现其规律，而且可根据拟合结果对水凝胶的平衡溶胀比进行推算，从而便于进行相关研究。

2． 2 溶液 pH 对 PCH 溶胀的影响

2． 2． 1 水凝胶在不同 pH 溶液中的溶胀情况

不同配比的水凝胶分别在 pH 值为 2 ～11 的各组溶液中的溶胀比随时间的变化情况如图 3 与图 4 所示，由拟合计算结果得出的平衡溶胀比如表3 所示。通过对图 3、图4 与表 3 中每一种水凝胶平衡溶胀比的比较可知: 在相同 pH 溶液中，水凝胶的平衡溶胀比都是 1 号 ＜ 2 号 ＜ 3 号 ＜ 4 号 ＜ 5 号，规律类似 PCH 在蒸馏水中的溶胀情况。PCH 在不同 pH 溶液中的平衡溶胀比与在蒸馏水中的情况相比，1 号和 2号的 Qe 值均有所增加，而 3 号、4 号的检测结果有所波动，平衡溶胀比有部分增加、也有减小，5 号的平衡溶胀比则稍有降低。PCH 的溶胀行为除了受水凝胶配比和溶液中的电解质影响以外，还会与溶液的 pH 值有关系。原因在于 1 号与 2 号水凝胶中的胶原含量较少，链段较刚性，离子浓度对其影响较小，但 PVA 的含量较高，其羟基的质子化作用可使链段伸展，同时胶原氨基的质子化或羧基的去质子化，可使得凝胶内的孔隙增加，平衡溶胀比增加。5 号水凝胶则是因为胶原含量较高，链柔性较高，离子强度对其有较大的影响，使其平衡溶胀比下降。3号水凝胶的溶胀情况可能是水凝胶配比、溶液中的电解质和溶液的 pH 值综合影响所致。

2． 2． 2 相同配比的 PCH 在不同 pH溶液中的平衡溶胀比

相同配比 PCH 在 pH 值为 2 ～ 11溶液中的平衡溶胀比变化如图 5 所示。大致规律为，在较低和较高 pH 值的溶液中，凝胶的平衡溶胀比都比中性溶液中的高，且在酸性条件下凝胶的平衡溶胀比略高于碱性条件下凝胶的平衡溶胀比。可见，胶原 － PVA 水凝胶具有一定的 pH 响应性。这是因为在高分子网络中的胶原分子链上既有酸性基团—COOH，又有碱性基团—NH2。当溶胀介质 pH 值低于胶原的等电点时，—NH2被质子化而带正电荷。同时 PVA 分子链中的—OH 也部分质子化而带正电荷，由于整个高分子凝胶网络带正电荷而使分子链间相互排斥，易于伸展，凝胶表现出较高的溶胀比。当溶胀介质偏碱性时，—COOH 则转变为—COO－，使凝胶网络带负电荷，高分子链间相互排斥而易于溶胀［23］。但当溶胀介质的 pH 值进一步增加时，凝胶的溶胀比略有下降，这可能是由于在更高值的溶胀介质中，凝胶网络中 PVA 分子链上的羟基去质子化作用增强，使其自身伸展受到限制，从而在凝胶内部形成 PVA 分子链的局部收缩，又因为分子链与胶原分子链间存在次级键，所以分子链的这种局部收缩会引起整个凝胶网络溶胀 比 的 下 降。在 胶 原 等 电 点 附近，—NH2与—COOH 之间离子键合，形成一种较紧密结构，因而不易溶胀。同时由 Donnan 平衡理论可知，凝胶的溶胀主要是由凝胶内外自由离子浓度差所产生的渗透压决定。当溶胀介质pH 较低时，水凝胶主要带电基团是质子化的氨基 ( —NH3+) ，当 pH 较高时，是脱质子化的羧基( —COO－) ，在这些范围内，凝胶内部自由离子的浓度大于环境中离子自由浓度，由此产生的渗透压使凝胶吸水膨胀以降低凝胶内电荷。当 pH 正好处于胶原 －PVA 的等电点时，—NH3+和—COO－所带电荷相当，相互之间的静电吸引使水凝胶内自由离子浓度几乎为零，外界渗透压使水凝胶脱水收缩。但是只有 3 号材料在碱性条件下呈现下降的规律，可能是因为 3 号水凝胶的配比使得 PVA 的羟基去质子化作用，随着溶液 pH 值的增加而增加，链段因斥力作用减弱而收缩［24］，而胶原中的—COO－间的排斥作用不及前者，因此 3号的平衡溶胀比有所减小。1 号、2 号水凝胶虽然也会因 PVA 的羟基去质子化作用随着溶液 pH 值的增加而增加，链段因斥力作用减弱而收缩，但是又因为其链段较刚性，当收缩到一定范围时便不再收缩，胶原中的—COO－间的排斥作用便占主要作用，从而平衡溶胀比有所增加。4 号、5 号水凝胶则是因为胶原含量的增加，胶原中的—COO－间的排斥作用增强，所以平衡溶胀比有所增加。

2． 3 水凝胶在不同 pH 溶液中的溶胀－ 消胀行为

不同水凝胶在 pH = 1． 9 和 pH =8． 4 溶液中的溶胀比随时间的变化如图 6 所示。通过图 6 可以看出: 1 号 －4 号水凝胶在溶胀 － 消胀试验的时间内吸水到达平衡后，未出现较为明显的溶胀 － 消胀特性，并未进一步吸水或失水。5 号水凝胶在试验时间范围内，有一定的溶胀 － 消胀特性。可能原因主要是 1 号、2 号、3 号和 4 号中的胶原含量过低，氨基与羧基含量少，凝胶内与正( 负) 离子结合的量少，很难因带同种电荷而排斥使得聚合物松弛，溶胀比发生改变。除此之外，还因其在 pH 不同的溶液中，平衡溶胀比本来改变就不大，对 pH 敏感度不高。还可能因为试验时间较短而未发现其轻微的溶胀 － 消胀特性。而 5 号水凝胶出现明显的溶胀 － 消胀特性，斜率出现了较大的负值，在 pH 值为 8． 4 时有失水现象发生。5 号水凝胶可能因其胶原含量相对较高，所以对溶液 pH 较为敏感。从表 3 可以看出: 随着胶原含量的增加，水凝胶在 pH = 1． 9 的溶液中的平衡溶胀比相对于其在 pH =8． 4 的溶液中的平衡溶胀比，从增加逐渐到减少的过程，进一步说明关于溶胀比变化的解释是正确的。

3 结 论

胶原 － 聚乙烯醇水凝胶有如下溶胀特性: 原料的不同配比对 PCH 溶胀速率有很大的影响，胶原含量越高，溶胀速率越大，其中 4 号与 5 号水凝胶的溶胀速率都很快，在溶胀近 100min左右时就可以达到溶胀平衡，而 3 号水凝胶达到溶胀平衡需 400min 左右，且 1 号和 2 号水凝胶则需时更长。水凝胶的配比还对平衡溶胀比有较大的影响，水凝胶中胶原含量越大，平衡溶胀比越大。胶原相对于聚乙烯醇碳碳刚性骨架来说，是相对柔性结构，可更为伸展。因此胶原含量的增加可增大PCH 溶胀速率与平衡溶胀比。而又由于胶原具有部分蛋白质的两性性质，所以电解质的浓度可对 PCH 的溶胀性质有影响，比如影响其水化层和双电层厚度等。电解质可降低胶原含量较高的 PCH 的平衡溶胀比。不同 pH对 PCH 有影响，对于胶原含量较少的水凝胶来说，不同 pH 溶液均可增加其平衡溶胀比，而对于胶原含量高的水凝胶，不同 pH 溶液均可减小其平衡溶胀比。因此，PCH 具有一定的 pH 敏感特性，一定的 pH 溶胀 － 消胀性能。