猪的繁殖调控技术(四)
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中图分类号:S828.3文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)04-0004-04
第六讲猪的胚胎移植技术
猪的胚胎移植是指将一头母猪的早期胚胎取出,移植到另一头生理状态相同的母猪生殖道内,使之发育成为新个体的技术,又称之为“人工受胎”或“借腹怀胎”。提供胚胎的个体称为供体,接受胚胎的个体称为受体。一头刚刚出生的母猪卵巢上有数以万计的卵母细胞,但终其一生能发育成熟、排卵、受精并形成新个体的是极少数。如果应用胚胎移植并结合超数排卵技术,则可以使其繁殖的效率提高几倍甚至几十倍。如果说人工授精是提高良种公猪繁殖力的有效方法,那么胚胎移植则为提高良种母猪的繁殖力提供了新的技术途径。
猪胚胎移植试验成功最早于1951年由Kvashickii报道。到20世纪60年代,已经基本建立了外科手术方法采集和移植胚胎的技术。由于猪是多胎动物,繁殖力较高,用胚胎移植技术从少数优良个体获得较多后代的要求不像牛羊那么迫切,因而一定程度上制约了胚胎移植技术在养猪生产中的应用。尽管如此,到70年代以后,北美和欧洲也开始将胚胎移植技术应用于向闭锁猪群引进外血和国际间的引种。近年来,猪的胚胎移植技术日趋成熟,成功率大大提高,国内外已开始应用于良种猪和特殊品种猪的繁殖和育种。
猪胚胎移植的基本技术程序包括:供、受体的同步,供体的超数排卵和配种,胚胎的采集,胚胎的质量鉴定,胚胎的短期培养和胚胎的移植。如图5所示。
有关同步和超数排卵技术,本讲座的第一、二讲已有详细介绍。本讲从“胚胎的采集”开始叙述。
1胚胎移植前的各项准备工作
1.1集卵管的制备
用于输卵管冲卵的集卵管,长130～140mm、壁厚0.8～1.1mm、内径3～4mm的玻璃管;用于子宫角冲卵的集卵管,外径10mm、长130～140mm的玻璃管;两种玻璃管均在酒精喷灯上中间弯成120°～140°角,两端烧制、研磨平滑。
1.2拣卵管和移卵管的制备
拣卵管和移卵管相同,在酒精灯上拉制内径为300～400μm的玻璃吸管,如图6所示。
1.3表面皿的准备
准备直径为8～10cm的表面皿,做为冲卵时接收冲卵液用。每个供体猪需备2～4个皿,写好编号,放入培养箱待用。
1.4移植套管的制作
移植套管可用比移卵管前部略粗、外径3mm、长约4cm的塑料细管,紫外灯下灭菌备用。
1.5手术器材的准备
将手术所需要的器材(手术刀、手术剪、止血钳、持针钳、巾钳、缝合针、缝合线、创巾、沙布、表面皿、拣卵管、冲卵管等)高压灭菌。临手术时将金属器械浸泡在0.1%新洁尔灭液中备用。
1.6冲卵液的配制
在试剂公司购置成品PBS或DPBS粉剂,按其说明书用双蒸水配制。
1.7培养液的配制
短暂培养可以用冲卵液,但需加入10%的小牛血清。用0.22μm的滤膜过滤灭菌,然后分装保存,待用。
1.8手术室的准备
猪场开展胚胎移植工作,人工受精的处理室即可代替手术室。每次手术之前,手术室需用福尔马林熏蒸消毒。通气之后,再用紫外灯照射。
2胚胎的采集
2.1采集的时间
根据采胚部位的不同,可分为输卵管采胚和子宫角采胚。如果从输卵管采胚,应在最后一次配种的48h内进行;如果从子宫角采胚,则应在最后一次配种的48～120h进行,同时应注意不同发育时间胚胎在子宫角所处的部位。供体猪采胚手术前应停食12h。
2.2供体猪的麻醉和保定
供体猪上腭牵拉,限制活动,将戊巴比妥钠(2.5%)按20～30mg/kg体重或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8%,硫酸镁5%)150～200mL耳静脉注射,进行全身麻醉。由于个体之间对的敏感性不同,所以在注射时要随时观察猪的神态,注射的速度要慢,防止过量。一般在眼睑刚刚失去反应,蹄部刺激无明显反射时即可。
麻醉到位后仰放在手术保定架上,四肢固定。为防止手术过程中猪的挣扎、动弹,要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠。为使腹腔内脏向前倾斜,方便手术,手术台要前低(头低)后高(尾高)。手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
2.3手术部位及其消毒
用肥皂水和毛刷洗刷术部,水洗后用毛巾揩干净。手术部位一般选择在倒数第2、3个之间,先用电剪或毛剪在术部剪毛,应剪净毛茬,用清水洗净术部,然后涂以2%～4%的碘酒,再用70%～75%的酒精棉脱碘。消毒程序是:碘酊棉球酒精棉球,由内向外。盖创巾于术部,使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
2.4手术方法
沿腹中线,尽量避开血管,切开皮肤5～8cm,钝性分离脂肪和肌肉层,使腹膜露出后,用钝头剪刀剪开腹膜。术者将食指及中指由切口伸入腹腔,在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角,摸到后用二指夹持,牵引至创口的表面。循一侧子宫角导出输卵管及卵巢,观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
2.5输卵管采胚
将集卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1～2cm,用大拇指和食指固定,另一端接表面皿。用注射器吸取37℃的冲卵液15～20mL,在宫管结合部将针头朝输卵管方向插入,推注射器,冲卵液由宫管结合部流入输卵管,经输卵管流至表面皿。
再将另一侧输卵管引出切口之外,用同样的方法冲胚。
2.6子宫角采胚
根据冲卵时间的不同,在距宫管接合部30～70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔,插入子宫角集卵管,开口向宫管结合部方向,另一端开口接表面皿或平皿。用注射器从宫管结合部向子宫角注入30～50mL冲卵液。冲卵液流经子宫角,将胚胎带入接卵的表面皿或平皿。鉴于子宫角过长,也可以采取分段冲卵的方法。
再将另一侧子宫角引出切口之外,用同样的方法冲胚。
2.7拣卵
将接卵的表面皿置于显微镜下,用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎。猪胚胎直径为150μm左右,肉眼观察只有针尖大小,为一球形体,在镜下呈圆形,其外层是透明带。拣卵管先吸入少许PBS再吸入卵,依次在第二个表面皿内重复冲洗,然后把全部卵集中到一个表面皿,一只供体的卵放在一个皿内。操作室温为20～25℃。
2.8供体的术后处理
供体采胚完毕后,用37℃灭菌生理盐水湿润子宫,冲去凝血块,将器官复位。腹膜、肌合后,涂抹磺胺等消炎防腐药。皮肤缝合后,在伤口周围涂碘酒,肌注青、链霉素。
3胚胎的质量检查及短期培养
3.1胚胎的质量检查
在显微镜下观察胚胎的形态、卵裂球大小与均匀度、色泽、细胞密度、与透明带间隙以及细胞变性等情况。正常发育的胚胎,其卵裂球一般外形整齐清晰,大小一致,分布均匀而紧密,发育速度与胚胎日龄相一致。对发育正常的胚胎供移植或体外培养,淘汰未受精卵及发育异常的胚胎。不同发育阶段的早期胚胎以及异常卵的形态见图7、图8。
3.2胚胎的短期培养
发育正常的胚胎如不马上移植,可做短期培养。将胚胎放入用培养液制成的悬滴内,每个悬滴可放5～10枚胚胎;然后置于37℃、5% CO2培养箱中。这种方法可培养1～2d。如需较长时间的培养,则要更换培养基。
4胚胎移植
4.1移植的部位与数量
胚胎移植的手术过程与胚胎采集一样。一般来讲,如果不加培养,从输卵管冲出的胚胎应移入受体的输卵管内,从子宫角冲出的胚胎应移入受体的子宫角内。如果是经过培养的胚胎,或体外生产的胚胎,则要根据胚胎发育的阶段,移入相应的部位。
由于猪是多胎动物,至少要移入4枚以上的胚胎,才能产生足够的妊娠信号,使胚胎着床。一次移入15枚左右发育正常的胚胎,可以确保正常的受孕率的产仔数。而移入20枚以上的胚胎,既不会提高受孕率,也增加不了产仔数,反而浪费取之不易的胚胎。移入10枚以下的胚胎,受孕率和产仔数都将受到影响。
4.2吸卵的方法
移卵管吸取胚胎时要采用三段式,即气泡―卵―气泡,如图9所示:
4.3输卵管移植
受体按供体的手术方法麻醉保定后切口,将输卵管和卵巢引出切口之外。先将移植套管从输卵管伞口插入输卵管至壶腹部,然后将吸有胚胎的移卵管插入套管,再将套管退出一部分,最后将移卵管内的胚胎和培养液吹入输卵管内。移植完毕,小心将移卵管和套管退出,复原输卵管伞。移卵之后的移卵管吸取PBS,置于显微镜下,检查有无余卵。若发现有未移入卵,要重复上述步骤,移到另外一侧输卵管。确定管内无余卵后,即可将卵巢、输卵管或子宫角清洗,送入腹腔,缝合术部,涂碘酊,腹腔注射抗生素。
由于猪着床前的早期胚胎,从输卵管进入子宫角后是游动的,最后会基本按等距离排列着床于两侧的子宫角内,因此移入一侧的输卵管内即可。
4.4子宫角移植
手术使子宫角露出切口之外。把位于宫管接合部约5cm处的子宫角下方的子宫系膜用拇指和食指牢牢固定,避开血管,用钝针垂直于表面刺入到子宫角内腔,制成小孔。再将预先吸有胚胎的移卵管从小孔插入子宫角腔内,将胚胎注入子宫腔内。
4.5受体母猪的管理
移植后的受体母猪,最初几天,要注意每天两次注射抗菌素,防止创口感染。同时,要单栏饲养,以防止猪只之间打架,弄破伤口或流产。受体母猪的营养水平,按怀孕母猪的日粮配合即可。怀孕中后期,注意补充青饲料,做好观察。
5猪胚胎移植的效率
猪胚胎移植的效率受操作人员技术熟练程度的影响。现将湖北省农业科学院畜牧兽医研究所开展的猪胚胎移植情况介绍如下。
5.1胚胎采集的效率
从表8可见,输卵管采胚的获胚率接近100%,且明显高于子宫角。
5.2胚胎移植的效率
从表9可见,输卵管移植的受孕率和产仔数略低于子宫角移植,但两者的差异不显著;接近正常配种的水平。
5.3关于供体的重复利用
供体母猪只有能重复利用,才能使优良母猪的繁殖效率得到提高。供体母猪能否重复利用,一是取决于超排后激素的残留及影响,二是取决于外科手术的影响。PMSG的半衰期为8～10d,HCG的半衰期为12～36h。董伟先生研究了PMSG在体内的存留期,测定的结果表明一般在10d左右。连续3次(间隔35d)注射PMSG,血液中未检测出PMSG的抗体。因此,PMSG的适量使用,一般不影响下一个情期的正常。猪手术取卵切口较小,一般不超过10cm,只要按规定的程序处理,5～7d内即可完全愈合。笔者观察了56头湖北白猪青年母猪,在超排并手术取卵后,有52头在17～20d,配种后正常受孕和产仔。
综上可见,猪胚胎移植技术已经达到了实用的水平。
6胚胎移植技术在养猪生产中的应用
在以下几方面,猪的胚胎移植技术具有推广应用的价值。
6.1应用胚胎移植技术对优良母猪实施频密产仔
以遗传性能优良的母猪做供体,杂交母猪、地方母猪或其他不能留做种用的母猪为受体,实施频密产仔。可采用两种繁殖模式。
(1)一年产4胎的繁殖模式:保守的做法,可将胚胎移植与自然配种相结合,如图10所示。这样的繁殖模式可使优良母猪每年繁殖4胎,可增加产仔数16头左右,提高优良母猪的繁殖力将近一倍。
(2)一年产9胎的繁殖模式:优良母猪只做供体,专事提供胚胎,每两个情期超排、冲卵一次,全年可提供9窝胚胎,移植给9头受体,获其后代72头左右,提高繁殖力3.0～3.5倍。
6.2特殊品种的快速扩繁
某些特殊品种猪,例如:香猪,版纳猪,五指山猪,野猪等,普遍繁殖力很低,一般产仔数在4～6头左右,应用胚胎移植技术可大大提高其繁殖力。以特殊品种猪做供体,其他品种或杂交猪做受体,可以大大加速特种猪的繁殖。
6.3地方猪的品种改良
目前,地方猪的品种改良,普遍采用引进良种公猪与地方母猪杂交的方式,得到的后代为杂种猪,不能做种用。如果采用胚胎移植的方式,以良种猪做供体,地方母猪做受体,得到的后代即为纯种猪,从而大大加快改良的进程。
6.4猪的MOET育种
超数排卵与胚胎移植(MOET)是一项日趋成熟的胚胎工程技术,而且近年来对其在家畜育种中应用的研究与实践不断深入。通过MOET可使供体的繁殖后代增加2～5倍。据报道,应用MOET育种技术,动物生长性状的年遗传进展可比正常繁殖法提高70%～80%。
6.5用胚胎的运输代替种猪的运输
目前猪场引进种猪,不仅耗费昂贵的运输费,运输过程中种猪应激、减重、死亡也不可避免,更重要的危害还在于各种病原的传播,给猪场带来损失。用胚胎的运输代替种猪的运输,能有效地克服上述缺陷,不仅可以节省开支,而且可防止各种病原的传播。
(全文完)