链脲佐菌素诱导建立长期稳定糖尿病小鼠模型的给药方案研究

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[摘要] 目的 探讨链脲佐菌素（STZ）诱导法建立稳定且长期维持的糖尿病小鼠模型的优化给药方案。 方法 将60只C57BL/6J小鼠随机等分为对照组和5个模型组（n = 10），其中，多次低剂量给药法（每日腹腔注射1次，连续5 d）3组，STZ剂量为60、70和80 mg/kg；一次性给药法（药物一次性腹腔注射）两组，剂量分别为160、200 mg/kg；对照组注射等量的枸橼酸盐缓冲液。监测各组小鼠不同时期随机血糖、饮食量、体重、成模率和死亡率等指标。 结果 各模型组小鼠均出现典型的“三多一少”的表现，血糖显著高于对照组。80 mg组和200 mg组1周成模率分别为100%和70%，但随着时间延长，死亡率明显增加，12周两组成模率均为30%；160 mg组小鼠血糖水平相对较低，1周成模率仅为40%，12周成模率为0；60 mg组4周成模率为70%，但后期血糖水平下降，12周成模率仅为30%，并且血糖波动较明显。70 mg组1周成模率为100%，12周时成模率仍高达70%，而死亡率仅为20%，显著高于其他模型组，且平均血糖水平波动很小，一直稳定保持在20 mmol/L以上。 结论 腹腔注射链脲佐菌素可以很好地诱导小鼠血糖升高，多次低剂量（70 mg/kg）给药方案是建立长期而稳定的糖尿病小鼠模型较优的诱导方案。

[关键词] 链脲佐菌素；慢性并发症；糖尿病模型；小鼠；多次低剂量

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（a）-0007-04

链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）是一种广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤的性能，还有致糖尿病的作用[1]。该药对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，能诱发许多动物产生糖尿病，因其操作简单、成模快、对机体组织毒性相对较小、动物存活率高、造模长期稳定性好等诸多优点，现已被广泛应用于制备糖尿病动物模型[2-3]。

目前的文献报道中，由于动物的品种、年龄、给药方式和剂量、给药途径、是否空腹以及是否使用高糖高脂饲料等许多方面因素不同，STZ的药物使用和管理差异悬殊[4]。有一次性给药方法[5]，也有连续多次给药方法[6-7]，使用的药物剂量也从20 mg/kg至240 mg/kg不等[5-7]，得到的模型的血糖水平以及血糖维持时间也有差距。目前关于糖尿病小鼠模型的药物诱导方案，已有许多文献报道，但由于研究目的和方法的不同， STZ诱导建立糖尿病小鼠模型并没有一个广泛认同的标准方案，尤其是目前的糖尿病模型研究多以近期（4周）为研究终点，模型动物多用大鼠[8]，对如何建立一个长期而稳定的糖尿病小鼠模型的研究还很少，但这对于研究糖尿病慢性并发症非常关键。因而，为了得到一个较稳定、维持时间较长的糖尿病小鼠模型，笔者对STZ的给药方案进行了探索和优化。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件

SPF级8～10周C57BL/6J雌性小鼠60只，体重19～21 g，购于中山大学北校区实验动物中心，在中山大学北校区实验动物中心的屏障环境中饲养，使用普通小鼠饲料（非高脂高糖饲料），小鼠的饲养环境湿度保持在50%～70%，温度保持在20～24℃，每天保持12 h的昼夜循环。所有有关动物的实验过程均在中山大学实验动物伦理委员会的监督、指导下完成，符合实验动物伦理学要求。

1.2 实验材料

STZ购自Sigma公司，柠檬酸三钠和柠檬酸购自广州化学试剂厂，快速血糖仪及血糖试纸（稳豪）购自强生公司。STZ溶液的配置：用灭菌0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH=4.5）溶解STZ粉剂，制成1% STZ液，现配现用。

1.3 分组及给药方案

将60只C57BL/6J小鼠在动物中心屏障环境中进行适应性饲养1周，然后随机分为1个对照组和5个不同的给药方案组，每组10只小鼠。给药方案：多次低剂量给药法（每日腹腔注射1次，连续5 d）3组，STZ剂量分别为60 mg/kg、70 mg/kg和80 mg/kg；一次性给药法（药物一次性腹腔注射）两组，药物剂量分别为160 mg/kg和200 mg/kg（分别称为60 mg组、70 mg组、80 mg组、160 mg组和200 mg组）。首次给药前，禁食16 h，不禁水，第二天起，不再禁饮食。对照组给予相同体积的无菌0.1 mol/L柠檬酸缓冲液腹腔内注射，一日一次，连续5 d。各组小鼠称重后分笼饲养，并分别做好标记。

1.4 观测指标及模型标准

各组小鼠处理后常规进食、饮水。在给药前以及注射药物结束后第1、4、8周和12周等时间点，检测小鼠的血糖、体重、饮食量，同时观察小鼠的精神状态和大小便情况。血糖的检测：通过剪尾采取尾静脉血，用快速血糖仪测定小鼠的随机血糖，血糖大于16.7 mmol/L并持续维持在该水平以上，则认定小鼠糖尿病模型造模成功。死亡率=死亡数/样本量×100%。造模成功率=成模数/样本量×100%。

1.5 统计学方法

所有数据录入SPSS 16.0统计软件，计量资料的数据以均数±标准差（x±s）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，率的比较采用χ2检验（Fishers确切概率法），以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

模型各组成模后，饮食量明显增加；尿量明显增多，需要每日更换垫料；糖尿病小鼠在后期出现精神变差、萎靡，活力减退、脱毛等表现。正常对照组小鼠精神状态、饮食、大小便等在给药前后均未见明显差别，垫料每周常规更换2次即可。给药前，对照组和各不同剂量模型组之间在体重、饮食量和血糖等方面差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 各组小鼠不同时期血糖水平的变化

对照组在给药期间以及给药后，血糖均保持稳定在4.5～9.3 mmol/L。不同剂量模型各组在给药后1～4周，血糖均有明显升高，此后各模型组血糖水平均出现不同程度的下降，有些模型不能维持较长时间，尤以60 mg组和160 mg组表现明显，平均血糖值降至10.86～12.65 mmol/L。但70 mg组和80 mg组模型小鼠血糖在第12周仍能持续维持在20 mmol/L以上，有良好的稳定性。见表1。

2.3 各组小鼠不同时期体重情况

各组小鼠在给药前平均体重为20.4 g左右，随着鼠龄增大，对照组小鼠体重逐渐增加，而模型各组体重在给药后1～4周的体重均明显下降，尤其70 mg组、80 mg组和200 mg组最明显；8～12周各模型组体重均有所增加，但仍低于对照组。糖尿病小鼠表现出明显“一少”（体重下降）。见表2。

2.4 各组小鼠不同时期饮食量情况

给药后，各模型组小鼠的日均饮食量均明显增加，饮食量的改变与血糖的高低具有较密切的联系，70 mg组和80 mg组血糖持续在较高水平，其饮食量增加也最明显，饮水量稳定在15 mL左右，高出对照组的3倍以上；而60 mg组和160 mg组饮食量的增加虽不如前两组明显，但也明显高于对照组，糖尿病小鼠表现出明显的“多饮”、“多食”。见表3、4。

2.5 给药后各组小鼠不同时期死亡率和造模成功率

给药后，在1～4周，多次低剂量注射的三组模型成模率较高，而一次性注射组成模率不足，尤其是在糖尿病后期（12周），160 mg组中没有一只达到糖尿病的标准，200 mg组成模率只有30%。160 mg组的死亡率最低，12周时全部成活，其成模率低主要由于血糖水平不高所致；200 mg组第1周是成模率有70%，但由于死亡率较高（12周死亡率达40%），导致其12周的成模率只有30%。60 mg组虽然死亡率很低，在4周成模率也达70%，但随时间延长，血糖降低，第12周的成模率只有30%；80 mg组成模率高（1周为100%），存活的小鼠均达模型标准，但死亡率很高，尤其是12周时，死亡率达70%，因而其后期（12周）的成模率也只有30%；70 mg组表现最好，成模率高，死亡率低，12周的成模率为70%，明显高于其他组。见表5、6。

3 讨论

糖尿病（DM）为全身代谢性疾病，会引发各器官的损害，引起相应的并发症，这些并发症往往需要糖尿病发生很长时间后才会出现。因而，要对糖尿病的这些并发症进行研究，首先就需要建立一个长期而稳定的糖尿病模型。

STZ是用于诱导建立糖尿病动物模型的经典药物，其诱导成DM的基本机制可能在于B细胞通过胞膜GLUT2摄取，再通过和（或）甲基化损伤，诱导B细胞凋亡；DNA损伤使得PARP过度激活而使B细胞因能量衰竭而死亡；更可能通过抑制OGN使得O-GlCNac堆积，影响胰岛素的释放[10]。由于动物的品种、实验目的等不同，STZ的使用和管理差异很大，包括给药方式和剂量、给药途径、是否空腹以及是否使用高糖高脂饲料等许多方面[4]。比如在给药途径方面就存在静脉注射、腹腔注射、皮下注射和心内注射等诸多不同[9]。另外，STZ具有毒性和副作用，使用剂量过大则小鼠容易出现死亡，剂量不足则成模率不高[10]。因而，选择怎样的给药方式，以及如何确定给药量，在建立长期的糖尿病模型中显得非常重要。

本实验中，笔者对比了多次低剂量注射和一次性注射的给药方法，以及不同剂量的建模效果，最重要的是观察长期（12周）的糖尿病模型的成模率。结果显示STZ可以很好地诱导小鼠血糖升高，并出现糖尿病典型的“三多一少”症状，给药剂量越大，血糖越高，症状也越明显；另外，无论是一次性给药还是多次给药，给药后的早期，血糖均迅速升高，成模率较高，但随着时间延长，血糖有逐渐下降的趋势，这一特点与文献的报道类似[11]。

一次性给药方案中，给药剂量少（160 mg）则成模率很低，大剂量（200 mg）组成模率有所升高，但远期（12周）的死亡率也明显增加至40%，导致成模率仅有30%。因而一次性给药方法并不适合于建立慢性的糖尿病模型。多次低剂量给药方案中，60 mg组死亡率很低，前期的成模率可以达70%，但到后期血糖逐渐降低，成模率明显下降；80 mg组早期的成模率达100%，但血糖过高至后期死亡率上升，12周成模率也只有30%；70 mg组早期成模率也为100%，死亡率也很低，血糖下降不多，因而12周时成模率仍高达70%，是较优的给药剂量。

空腹给药可以增加胰岛细胞对STZ的敏感性，较低的药物剂量就可以达到较好的造模效果[4，12]，笔者预实验中也观察了非空腹给药的效果，发现相同剂量时，成模率低，增加剂量则死亡率上升，所以笔者选择了空腹注射方法。高糖高脂饮食也是一种诱导糖尿病模型的方法[2]，而高糖高脂饮食联合STZ也被研究者用于建立糖尿病模型[13-14]，本研究并未对这一方案进行优化对比，主要在于该方案需要预饲养1个月以上，对于建立长期的模型来说，明显加大了试验周期，而且，本实验方法已经显示了非常好的造模效果，因而没有进一步对该方案进行比较。

总之，多次低剂量的STZ诱导糖尿病模型的方法，70 mg/kg的注射剂量能够快速成模，造模成功率高，而且模型很稳定，至少可以维持12周，是研究糖尿病慢性并发症的理想建模方法。

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（收稿日期：2012-11-05 本文编辑：郝明明）